2020年2月24日，安徽省农业科学院水稻研究所杨剑波/魏鹏程研究组在Nature Plants 发表了题为SpCas9-NG self-targets the sgRNA sequence in plant genome editing 的论文。该研究发现，SpCas9重要变体SpCas9-NG在植物基因组编辑中产生自编辑效应。目前广泛使用的CRISPR基因编辑工具来源于原核生物免疫系统。对CRISPR-Cas系统来说， PAM (protospacer adjacent motif) 的捕获才能启动Cas复合体的靶向切割活性，因此Cas-PAM识别对区分自身基因组和入侵外源序列至关重要。但是对于CRISPR基因编辑工具，PAM限制了该工具的可识别范围。广泛使用的SpCas9需要靶点附近有NGG PAM才能发挥作用，影响基因组编辑能力。通过改造Cas蛋白结构，进化可扩大识别范围的变体是提高编辑工具靶向能力的主要手段。例如，已开发的SpCas9多种变体SpCas9-VQR、SpCas9-VRER、 xCas9等，显著扩展了编辑范围。2018年报道的一个SpCas9变体，SpCas9-NG (R1335V/L1111R/D1135V/G1218R/E1219F/A1322R/T1337R)可将NGG PAM扩宽至NG PAM， 并对NGT， NGG和NGA PAM仍保持较高活性，有效地缓解PAM限制性问题 (Nishimasu et al., 2018)。在植物中，已有多个独立报道利用SpCas9-NG构建基因组编辑和碱基编辑工具，实现了基因组中SpCas9工具无法工作位点的有效编辑(Endo et al., 2019; Ge et al., 2019; Hua et al., 2019; Ren et al., 2019; Zhong et al., 2019)。然而，研究人员在构建作物SpCas9-NG工具的过程中意外发现， 相关农杆菌介导转化植株T-DNA中sgRNA序列-3位左右普遍存在高频小片段缺失现象（图1），暗示着SpCas9-NG可能导致自体靶向编辑。转化群体中T-DNA突变频率（自编辑）显著高于或与目标基因组突变（on-target）频率相似， 表明SpCas9-NG具有较强自编辑活性。自体靶向不仅存在于以GTTTC起始的esgRNA scaffold结构中，同样也出现在于以GTTTT起始的native sgRNA scaffold结构中， 而在作为对照的野生型SpCas9和xCas9-3.7系统中，没有观察到类似自身靶向效应。以SpCas9-NG构建的碱基编辑工具也存在同样的sgRNA序列自编辑问题。这些结果表明，农杆菌介导的植物SpCas9-NG基因编辑系统广泛存在着自体靶向编辑效应。 图1， SpCas9-NG在水稻中自编辑PDS-1 sgRNA进一步研究发现， sgRNA自编辑产生的突变sgRNA（碱基缺失）仍具有靶向能力，会导致意外的脱靶事件。此外，作者还发现自编辑效应可能是由于SpCas9-NG在基因组中对NTN等非典型序列的识别等原因造成。而通过使用以GCCCC 为起始的sgRNA scaffold结构可有效的降低SpCas9-NG的自编辑效应。该研究将促进SpCas9-NG 系统在植物基因组编辑中的合理利用，也将为进一步的编辑工具改良和验证工作提供参考。安徽省作物遗传育种重点实验室杨剑波研究员和魏鹏程研究员为论文共同通讯作者。相关研究在转基因专项和国家自然科学基金区域创新发展联合基金资助下完成。参考文献：
Endo, M., Mikami, M., Endo, A., Kaya, H., Itoh, T., Nishimasu, H., Nureki, O., and Toki, S. (2019). Genome editing in plants by engineered CRISPR–Cas9 recognizing NG PAM. Nature Plants 5:14-17.Ge, Z., Zheng, L., Zhao, Y., Jiang, J., Zhang, E.J., Liu, T., Gu, H., and Qu, L.-J. (2019). Engineered xCas9 and SpCas9-NG variants broaden PAM recognition sites to generate mutations in Arabidopsis plants. Plant Biotechnology Journal 17:1865–1867.Hua, K., Tao, X., Han, P., Wang, R., and Zhu, J.-K. (2019). Genome engineering in rice using Cas9 variants that recognize NG PAM sequences. Molecular Plant 12:1003-1014.Nishimasu, H., Shi, X., Ishiguro, S., Gao, L., Hirano, S., Okazaki, S., Noda, T., Abudayyeh, O.O., Gootenberg, J.S., Mori, H., et al. (2018). Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science 361:1259-1262.Ren, B., Liu, L., Li, S., Kuang, Y., Wang, J., Zhang, D., Zhou, X., Lin, H., and Zhou, H. (2019). Cas9-NG Greatly Expands the Targeting Scope of the Genome-Editing Toolkit by Recognizing NG and Other Atypical PAMs in Rice. Molecular Plant 12:1015-1026.Zhong, Z., Sretenovic, S., Ren, Q., Yang, L., Bao, Y., Qi, C., Yuan, M., He, Y., Liu, S., and Liu, X. (2019). Improving plant genome editing with high-fidelity xCas9 and non-canonical PAM-targeting Cas9-NG. Molecular Plant 12:1027-1036.
https://doi.org/10.1038/s41477-020-0603-9