看热门肿瘤靶点的倒下，数十篇论文顶不住3篇重复——验证肿瘤治疗靶点面临的挑战
过去20年中，已有近30多篇研究论文表明，MELK激酶在人类肿瘤中是一个非常有吸引力的靶点，针对该靶点开发的抑制剂有的已经进入一期临床试验【1】。然而最近3篇发表在eLife杂志上的论文宣告MELK对肿瘤的增殖其实没有影响，过去所谓的很多现象似乎都是假象【2,3,4】。如果真是这样，如果靶点都是错的，那么这些抑制剂还有研究和继续试验下去的必要吗？
针对上述问题，eLife杂志发表了一篇杂志社高级编辑Jeffrey Settleman、 Charles L Sawyers 和评审编辑Tony Hunter共同撰写的评论性文章，重点讨论了当前一些肿瘤治疗靶点经由重复性试验验证后所面临的一系列挑战【5】。
MELK（maternal embryonic leucine zipper kinase,母源胚胎亮氨酸拉链激酶）编码一种Ser/Thr 蛋白激酶，1997年在小鼠卵细胞和胚胎的cDNA文库中被鉴定出来【6】。过去有大量研究表明，MELK在乳腺癌、黑色素瘤、脑瘤、结直肠癌等肿瘤中高表达，并被认为与患者的不良预后相关。此外，许多研究表明MELK在多种肿瘤细胞中被激活，促使肿瘤增殖、侵袭和迁移等，这些过程与MELK调控细胞周期以及抗凋亡相关【7,8】。2017年底还有发表在Cell Reports上的文章报道MELK促进黑色素瘤的增殖是通过刺激NF-κB通路实现的【9】（事实上第一篇eLife上发表的否定性文章是2017年3月在线发表的，第二篇也是2017年9月在线的，居然这之后还能发得出论文，审稿人也太大意了吧）。
第一篇否定性文章
事实上三篇否定性的论文并不是一次性在线，而是前后相隔近一年。第一篇题为“CRISPR/Cas9 mutagenesis invalidates a putative cancer dependency targeted in on-going clinical trials”的论文于2017年3月上线（上图），研究人员运用CRISPR/Cas9系统在13个癌细胞系中敲除MELK后并没有观察到该基因对细胞增殖产生影响，这与过去运用RNAi技术证明敲低MELK后细胞增殖明显受到抑制的结论相矛盾。然而更诡异的是，在敲除MELK的癌细胞中使用靶向药物OTS167（进入临床一期试验的药物）仍然会抑制细胞生长并能杀死肿瘤细胞【2】。
第二篇否定性文章
第二篇否定论文很有来头，来自哈佛医学院 Dana-Farber肿瘤研究所Jane J Zhao实验室（上图）（Zhao实验室在开发乳腺癌药物靶点方面做了许多优秀的工作）。为什么说很有来头呢？因为该实验室2014年才在eLife上发表论文声称MELK是基底样乳腺癌细胞中加快细胞有丝分裂所必须的致癌激酶【10】。就在实验室进一步基于MELK开发新的抑制剂的时候，却发现过去基于RNAi的相关研究结果有误，在乳腺癌细胞中敲除MELK或者使用新筛选出来的抑制剂HTH-01-091（能够有效诱导MELK蛋白降解）之后，细胞仍然正常生长，生长速度无显著差异【3】。也就是说，2014年论文发表之后，时隔三年又被自己实验室给彻底否定了。说到这里，笔者非常认可这样的学术态度，研究人员直接否定过去可能因为RNAi实验中的脱靶效应得出的不正确的实验结论，实事求是，值得赞赏。
第三篇否定性论文事实上是第一篇否定性论文的延续，来自于同一个课题组（上图），于今年2月8号在线发表【4】。在这篇文章里，研究人员做了更多MELK基因敲除的不同肿瘤细胞系，并且还做了应对环境压力的系列实验。通过系列基因表达数据还解释了MELK的表达与临床预后的关联性，最终得出的结论是MELK表达与肿瘤有丝分裂活性有相关性，然而并不是肿瘤生长所需【4】。
一个研究20余年的基因，在有几十篇文献记录支持的情况下，在CRISPR/Cas9系统的验证下简直不堪一击。这里面最大的问题在于，过去基于siRNA和shRNA的研究存在很大的脱靶效应，这也给当前的研究人员敲响了警钟，以后发表重要论文如果还是基于这一套数据，那么审稿人就会argue脱靶问题要求去做脱靶性低的CRISPR/Cas9基因敲除实验了。
关于小分子抑制剂的问题。从供应商处获得的小分子化合物可能比RNAi试剂更成问题，这一问题主要来自于化合物的纯度的不确定性。据最近发表在Nature Medicine上的而一项报告显示（包括8500多份购买的小分子抑制剂的分析），这些化合物中有29％未通过质量控制测试【11】。
2007年Cell曾经背靠背发表某大牛实验室两篇论文证明NEDD4调控PTEN蛋白稳定性和定位，名噪一时，结果不到一年，PNAS发表文章用NEDD敲除的小鼠狠狠打脸【11】（如果没有诺奖得主Aaron J. Ciechanover的支持，这篇PNAS恐怕难以发出来），现在PTEN界大概不大会有人认为NEDD4是PTEN真正的E3泛素连接酶了。植物领域的ABP1有关的story就不再次赘述了，UCSD赵云德组的PNAS也是利用CAS9一剑封喉，使得过去发表在CNS的有关ABP1的文章蒙上了一层阴影，顶级大牛一下子灰头土脸，至今围绕ABP1基因敲除没有表型的话题成为了许多从事拟南芥相关研究的科研人员在茶余饭后的笑料，有兴趣的读者可以根据参考文献下载原文阅读【12】。
事实上，在大多数情况下，科学发现历来是一种自我纠正的过程。过去的研究被后面的成果推翻是常有的事情，有些错误是刻意造假，有的是无心之过，但无论是哪种情况，科学家今后都有责任对特别是涉及到一些临床药物靶点的研究工作时表现出更加审慎的态度。
最后，本文再次对eLife杂志发表这些验证性的工作表示支持和敬意。科学的自我净化，有时候需要壮士断腕的决心和勇气，eLife杂志近几年可以说大大推动了实验论文“可重复性报告”走入到学术舞台中央来，为净化学术生态做出了表率（eLife震撼推出5篇论文直指顶级研究可重复性差；eLife再次公布顶级热点论文可重复性报告）。
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参考文献：
1、Ji, W., Arnst, C., Tipton, A. R., Bekier II, M. E., Taylor, W. R., Yen, T. J., & Liu, S. T. (2016). OTSSP167 abrogates mitotic checkpoint through inhibiting multiple mitotic kinases. PLoS One, 11(4), e0153518.
2、Lin, A., Giuliano, C. J., Sayles, N. M., & Sheltzer, J. M. (2017). CRISPR/Cas9 mutagenesis invalidates a putative cancer dependency targeted in on-going clinical trials. Elife, 6.
3、Huang, H. T., Seo, H. S., Zhang, T., Wang, Y., Jiang, B., Li, Q., ... & Dastjerdi, S. (2017). MELK is not necessary for the proliferation of basal-like breast cancer cells. Elife, 6.
4、Giuliano, C. J., Lin, A., Smith, J. C., Palladino, A. C., & Sheltzer, J. M. (2018). MELK expression correlates with tumor mitotic activity but is not required for cancer growth. Elife, 7, e32838.
5、Settleman, J., Sawyers, C. L., & Hunter, T. (2018). Science Forum: Challenges in validating candidate therapeutic targets in cancer. eLife, 7, e32402.
6、Heyer, B. S., Warsowe, J., Solter, D., Knowles, B. B., & Ackerman, S. L. (1997). New member of the Snf1/AMPK kinase family, Melk, is expressed in the mouse egg and preimplantation embryo. Molecular reproduction and development, 47(2), 148-156.
7、Lin, M. L., Park, J. H., Nishidate, T., Nakamura, Y., & Katagiri, T. (2007). Involvement of maternal embryonic leucine zipper kinase (MELK) in mammary carcinogenesis through interaction with Bcl-G, a pro-apoptotic member of the Bcl-2 family. Breast Cancer Research, 9(1), R17.
8、Davezac, N., Baldin, V., Blot, J., Ducommun, B., & Tassan, J. P. (2002). Human pEg3 kinase associates with and phosphorylates CDC25B phosphatase: a potential role for pEg3 in cell cycle regulation. Oncogene, 21(50), 7630.
9、Janostiak, R., Rauniyar, N., Lam, T. T., Ou, J., Zhu, L. J., Green, M. R., & Wajapeyee, N. (2017). MELK promotes melanoma growth by stimulating the NF-κB pathway. Cell reports, 21(10), 2829-2841.
10、Wang, Y., Lee, Y. M., Baitsch, L., Huang, A., Xiang, Y., Tong, H., ... & Min, J. (2014). MELK is an oncogenic kinase essential for mitotic progression in basal-like breast cancer cells. Elife, 3.
11、Corsello, S. M., Bittker, J. A., Liu, Z., Gould, J., McCarren, P., Hirschman, J. E., ... & Asiedu, J. (2017). The Drug Repurposing Hub: a next-generation drug library and information resource. Nature medicine, 23(4), 405.
12、Fouladkou, F., Landry, T., Kawabe, H., Neeb, A., Lu, C., Brose, N., ... & Rotin, D. (2008). The ubiquitin ligase Nedd4-1 is dispensable for the regulation of PTEN stability and localization. Proceedings of the National Academy of Sciences, 105(25), 8585-8590.
13、Gao, Y., Zhang, Y., Zhang, D., Dai, X., Estelle, M., & Zhao, Y. (2015). Auxin binding protein 1 (ABP1) is not required for either auxin signaling or Arabidopsis development. Proceedings of the National Academy of Sciences, 112(7), 2275-2280.
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