13.5Kb CCS reads升级人类基因组变异识别和组装
短读长测序技术因准确度较高，常应用于单核苷酸变异（SNVs）和小型插入缺失（indels）的识别上，但是较少进行从头组装、单体型定相和结构变异（SVs）检测等远程应用上。基于单分子检测的长读长测序技术通过read-to read的校错也可以达到高准确度，只是计算量较大，并且在校正过程中错误映射的reads和混合单体型中仍存在错误，故较少应用于SNVs和indels识别。同时，人类基因组仍需要结合各种测序技术全面覆盖各类基因变异，而长读长测序技术尤其是基于SMRT测序的PacBio平台正好可以通过CCS来进行高精度的变异捕获。
来自PacBio的科学家Aaron M. Wenger联手多家机构的研究人员选取了理想的基准基因组样本HG002进行长CCS reads的表现分析以验证其在大、小片段变异检测、基因组组装和单体型定相等方面上的优势，研究结果已于1月发表于bioRxiv预印本期刊上，组学君再为大家细读好文。
长度紧密分布在15Kb的SMRTbell文库用于CCS测序，仅保留准确度高于Q20(99%)的reads，生成的89G数据平均读长13.5±1.2Kb，预估准确度中位数为Q30(99.9%)，平均值Q27(99.8%)，且与GRCh37一致性准确度高。
图1 HG002的高精度长读长测序（a. 多轮DNA模板测序生成CCS序列，b. 不同测序轮数得到的CCS序列质量预测，c. CCS reads的读长和预测质量）
研究统计了CCS reads和HG002参考基因组的不一致，其中3.4%为错配，4.6%为非均聚物背景下的indels，92%为均聚物背景下的indels。通过read-to-read比对的方式计算错误率发现与预估的CCS reads质量一致，平均reads精度高达99.8%。同时，研究还将其映射到GRCh37上，匹配度达97.5%，还发现对应的NGS短读长数据上报道的193个医学相关基因可以在CCS数据上映射152个，包含 CYP2D6、GBA、PMS2和STRC等基因。
图2 使用CCS reads的人类基因组可映射性（a.不同映射质量阈值下NGS和CCS数据对GRCh37人类基因组的覆盖度，b. NGS和CCS数据对先天性耳聋基因STRC分别在以10为映射质量阈值下的覆盖度，c. 13.5Kb CCS reads对193个人类基因的映射提升，这193个基因之前使用NGS数据进行映射发现与医学相关且存在问题）
GAKT用于SNVs和小型indels识别，相较于基准基因组，SNVs精度达99.468%，召回了99.559%；而indels的精度和召回率分别为78.977%和81.248%。针对SNVs和NGS数据进行比较，识别的indels相对少一些。研究还通过一种叫Google DeepVariant的模型进行数据模拟，发现相较于Illumina数据，CCS数据可以大大提高SNVs和indels的准确度和召回率。
接下来，研究又使用WhatsHap来定相DeepVariant识别的结果进行定相以确定CCS reads能够生成单体型所需的高精度变异识别和远程信息。几乎所有（99.64%）的常染色体杂合变异都被定相到19215个区域上，N50为206Kb。定相区域大小分布几乎和理论上的极限完全匹配，而这个极限是通过生成变异之间超过平均CCS读长13.5Kb的间隔来评估的，这说明定相区域大小受HG002基因组读长和变异量所限，而非变异识别的覆盖度或质量。
图3 使用CCS reads进行变异识别和定相（a. 使用DeepVariant进行的SNV和indels识别和基准基因组的一致性，b. 杂合位点的DeepVariant变异识别定相和使用13.5Kb reads对HG002理论定相的比较，c. 整合的CCS SVs识别和基准基因组一致性，d. 通过变异大小进行上述一致性的比较）
GATK和DeepVariant在识别变异时都不直接并入远程单体型相位信息。研究对CCS reads基于GIAB的三相变异对进行单体型标记，然后使用DeepVariant模型对reads按单体型分选通过的顺序进行模拟，发现对于SNVs的识别表现和原始的DeepVariant模型相近，但是对于indels的识别却有着显著的升级：精度达97.835%且召回率达97.141%（见表1）
表1 CCS reads小片段变异识别的表现
≥50bp的插入和缺失SVs使用两款基于read映射的工具pbsv和Sniffles，使用paftools分析Falcon和Canu的从头组装来升级更大片段变异的识别，研究发现使用SURVIVOR生成整合的callset对于＜1kb和≥1kb的变异以及插入和缺失的表现都相仿，凸显了基于映射的和基于组装的SVs识别之间的互补性（见图3c和d）。
另外，研究还对Illumina短reads和10×Genomics的连接reads(linked reads)进行SVs识别比较，发现所有的短reads和链接reads无论在准确度还是召回率上面都不及CCS callsets。
使用了Falcon、Canu和wtdbg2对CCS reads分别进行从头组装，跳过原始的read-to-read校错步骤的组装结果连续性都很好，contig N50从15.43到28.95Mb，其中Canu因为将一些杂合位点的等位基因算作分离的contigs上而组装的基因组大于预期（表2）。同时，研究选择了HG002亲本的短reads来鉴定对一方亲本唯一的k-mers然后基于单倍型对CCS reads进行分区（trio bin），最后选择51-mer的binning进行组装。
表2 CCS reads从头组装统计
三款组装软件独立对父系和母系reads进行组装也都得到高连续性的近完整组装结果，N50从12.10到19.99Mb，基因组从2.67到3.04Gb。父母系的组装中都鉴定出从95.3%到98.2%的单拷贝人类基因（表2），并且无论是混合组装还是一方亲本的组装都与HG002基准基因组保持高度一致，甚至大大超过了之前发表的使用PacBio长reads和用Illumina数据打磨过的ONT数据组装结果（图4a）。
此外，研究还组装到了跨度超60Mb的大片段重复，较之前提升了20%的连续性，以及解析了一致性99%-99.5%的15kb重复片段（图4b）。
图4 read准确度对从头组装的影响
研究者调取部分数据进行分析，发现对于SNVs，使用DeepVariant进行准确度和召回率超过99.5%的识别仅需15×的覆盖，而对于indels，超过90%的准确度和召回率需要17×。再者，使用混合单倍型的wtdbg2的组装，只要覆盖度高于15×，就可以保持高于Q42的一致性准确度等。
最后，研究对SVs仍处于草图形式的基准基因组进行校错，如鉴定到小片段变异中，31个基准基因组中的均聚物不一致处有29个被误为正确的；而在一项Illumina全基因组病例研究中，仅有很少的假阴性SNVs和indels以及假阳性indels和CCS callset相一致，通过人工处理后评估基准基因组中有2434个（95%的置信区间为1313-2611）错误可以通过CCS reads来校正。
对于SVs，基准基因组精确度比较高，但不一定完整。将CCS DeepVariant callset加入基准基因组小片段变异整合流程中可以将基准区域扩展1.3%相当于418875个变异。而18832个常染色体变异识别中仅有9232个和基准区域相重叠，也表明并入CCS变异识别可能可以将基准基因组中变异的数量翻2倍以上。
读长和准确度宛如测序天平的两端，这份研究开发出了一种新的流程力图让天平达到完美的平衡：研究基于单分子环状一致性序列（CCS）生成准确度达99.8%、平均读长达13.5Kb的长reads，还将该流程运用到已精确解析的人类基因组（HG002/NA24385）上。
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