走进细胞培养代谢副产物 - NH4+

细胞培养环境对单抗的产量和质量有着重大影响，如培养基成分、pH、DO、温度等，另外对细胞具有毒性的代谢副产物乳酸和铵的累积同样会影响细胞表现与抗体的产量和质量。培养基中乳酸的来源主要为葡萄糖的不完全降解，铵主要来自于谷氨酰胺的代谢降解和自发降解，当然其他一些氨基酸或血清成分的代谢也是铵的来源之一。众多学者就铵的机理及对细胞的生长、蛋白产量与质量的影响均有研究，文中笔者就铵的毒性机理、对细胞及蛋白的影响、降低铵的措施等进行简要概述。

1.胞内pH平衡

培养基、细胞质和线粒体内的氨(NH3)和铵离子(NH4⁺)之间一直处于一种动态平衡，它们之间的相互转化受所处环境的pH影响，NH3和NH4⁺的动态平衡是调节胞内pH处于稳态的方式之一。NH3是一种不带电荷、脂溶性的小分子，可通过自由扩散作用透过细胞膜，驱动力为膜两侧的浓度差；而NH4⁺的膜穿透速度却是比较慢的，因为其只能在能量的作用下通过Na⁺K⁺ - ATPase、Na⁺K⁺2Cl-转运蛋白等进出细胞膜，而且采用这种方式时NH4⁺需要与K⁺等离子竞争转运蛋白上的结合位点，可能会破坏细胞膜上的离子动态平衡，影响胞内稳态。

一般情况下，外界环境、细胞质和线粒体内的NH3和NH4⁺处于动态平衡，NH3在膜内外的自由扩散对细胞内的pH进行微调，但基本处于一种平衡状态，如图1a所示。当向培养基中添加NH4Cl或者由于培养基中谷氨酰胺自发降解导致的NH4⁺增加时，如图1b所示，在浓度梯度作用下NH3进入细胞内、线粒内及其他含膜细胞器内，从而使细胞内的pH上升，对酶活造成不利影响，从而会限制细胞生长和代谢。

图1 NH3和NH4+对细胞内pH的扰动及其电化学平衡 (图片来源于参考文献1)

2.底物代谢循环

NH3和NH4⁺对细胞的影响还体现在代谢上，铵可以通过与酶的结合位点相互作用而影响酶活，例如对谷氨酰胺酶和谷氨酰胺合成酶的影响。谷氨酰胺酶催化谷氨酰胺降解形成谷氨酸和铵，谷氨酰胺合成酶使反应向相反的方向进行，有研究报道称提高铵浓度可以刺激谷氨酰胺酶的活性，其具体机制还不明确。另外，谷氨酸在谷氨酸脱氢酶作用下的进一步降解时会产生氨和α-酮戊二酸，此过程需要NAD⁺的参与，如图2所示，同时氨和α-酮戊二酸合成谷氨酸的反应可以一定地解除铵对细胞的毒性效应。

此外，糖代谢的关键酶磷酸果糖激酶(PFK)的活性也受铵影响，高浓度的铵会扰乱糖代谢途径，导致乳酸浓度升高。还有研究发现，铵会促进细胞内UDP-N-乙酰半乳糖胺的合成，虽然作用机理还不明确，但高水平的UDP-N-乙酰半乳糖胺对细胞是具有毒性。由上可知，铵是底物代谢重要的参与者，同时也可影响部分酶的酶活，细胞培养过程中铵浓度失调对细胞生长的影响细胞是必然的。

图2 谷氨酸脱氢酶作用下的谷氨酸降解与合成过程 (图片来源于参考文献1)

1.细胞生长及代谢

通过外源性的添加NH4Cl，学者们就铵浓度增加对细胞的影响进行了研究，如图3所示，Yang等发现细胞密度随NH4Cl的增加而降低，与对照相比添加40mM的NH4Cl时细胞密度降低了56%, 而低浓度的NH4Cl (5mM之内)的对细胞的影响较小。

图3 不同浓度的NH4Cl对CHO细胞的影响(图片来源于参考文献2)

同时研究人员还对葡萄糖和几种氨基酸的比合成或消耗速率进行了测定，如下表所示，铵的添加增加了谷氨酸(glutamate)、丙氨酸(alanine)和甘氨酸(glycine)的合成速率，而加速了对葡萄糖和谷氨酰胺(glutamine)的消耗。铵浓度的提高不仅增加了细胞对能量的需求，还影响了细胞的代谢循环，进而影响细胞的正常生长。当然由于研究过程中采用的铵离子浓度往往超过细胞本身所产生的，并不能排除铵单一的对代谢影响的因素，还可能是胞内pH增加的原因。

(图片来源于参考文献2)

2.糖基化

细胞培养过程中高浓度的铵还会影响蛋白的糖基化水平，主要表现为降低糖链末端的唾液酸化水平、半乳糖苷化等。蛋白的糖基化过程发现在内质网和高尔基体内，有学者认为铵浓度的增加会增加膜类细胞器内的pH，进而降低糖基转移酶和N-乙酰氨基葡糖转移酶III/IV的活性；还有学者认为，铵的添加是通过扰动细胞的底物代谢平衡，而影响蛋白的糖基化水平。

Chen等就高浓度铵对CHO细胞糖基化的影响进行了研究，其通过定量PCR (QRT-PCR)技术对糖基化相关基因(14个基因)的扩增数进行了分析。将铵压力下CHO细胞和对照组的基因表达相比，发现有5种基因的表达对铵敏感，包括：UDP-半乳糖转运蛋白、β(1,4)-半乳糖基转移酶、α(2,3)-唾液酸转移酶、GMP-唾液酸转运蛋白和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。如图4所示，与对照相比添加铵的实验组α(2,3)-唾液酸转移酶和GMP-唾液酸转运蛋白水平较低，这不仅会导致胞液中唾液酸向高尔基体的转动量降低，还会影响糖链上的唾液酸连接，最终降低蛋白的唾液酸化。

数据也显示，铵浓度增加时，β(1,4)-半乳糖基转移酶基因的表达量也会降低，进而引起β(1,4)-半乳糖基转移酶减少，影响半乳糖基化。虽然此时UDP-半乳糖转运蛋白的表达会增加，但从没报道过铵的添加会增加蛋白半乳糖化，其中的机制还需要更多的研究。而铵浓度对于UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的影响则会阻碍唾液酸的合成，及其向高尔基体的转运，从而对唾液酸化产生不利影响。

图4 α(2,3)-唾液酸转移酶(α(2,3)-ST)和GMP-唾液酸转运蛋白(GMP-SiaT)的表达水平比较(对照，三角形；铵压力，正方形) (图片来源于参考文献3)

细胞培养过程中铵的来源有两个途径，一是谷氨酰铵(Gln)的自发化学降解，二是谷氨酰铵等氨基酸的代谢。为消除由于Gln自发降解产生的铵，限制培养基中Gln的添加浓度可以降铵的积累，另外可以用更为稳定的Gln派生物代替以减少其自发降解量，如甘氨酰谷氨酰胺。

大多数情况下，铵主要来源于谷氨酰胺酶作用下Gln转化成谷氨酸(Glu)的过程，Gln自发降解产生的铵只占极少一部分。如果将Glu，而不是Gln添加到培养基中便可有效的减少铵的生成，但同时也会在一定程度下降低细胞的生长速率。与Glu的出发点类似，其他氨基酸的添加也可降低铵的积累。Chen等进行了相关的研究，其通过外源性添加10mM NH4Cl到培养基模拟高浓度铵离子，并在此条件下测定了不同种氨基酸对细胞生长的影响。实验得出苏氨酸(threonine)、脯氨酸(proline)和甘氨酸(glycine)可以抑制高浓度铵对细胞的毒性，与对照相比，分别使细胞终密度提高了15%、20%和25%，如图5所示，其中丝氨酸(alanine)的添加作用负对照。对添加铵的实验组中对照组与苏氨酸、脯氨酸和甘氨酸实验组的代谢参数比较，发现氨基酸组的铵浓度要比对照组低，同时其谷氨酰胺浓度也要高些，而葡萄糖消耗和乳酸生成均要低些，这就说明三种氨基酸的添加促进了细胞的碳代谢与氮循环，从而促进细胞生长。

图5 氨基酸对高浓度铵离子添加培养基中细胞密度的影响 (图片来源于参考文献4)

优化细胞培养策略也可以降低铵的累积，例如对谷氨酰胺和葡萄糖的补料方式及补量进行优化，以其他糖类代替葡萄糖，如半乳糖、甘露糖、果糖等，主要是通过对细胞代谢路径的调控来减少铵累积。采用物理移除培养系统中的铵也是一种选择，例如透气型、疏水多孔膜，离子交换膜或离子交换树脂和电渗析等方法，然而这些方法只有应用于产生大量铵离子的高密度细胞培养中才能体现对活细胞密度和抗体浓度的改善。

细胞培养时代谢废物铵的累积不仅会影响细胞的表现，还会对抗体的糖基化产生影响，追问其机理可能与细胞胞内的pH平衡破坏与酶活下降有关。但是，对谷氨酰胺和葡萄糖的补料策略进行优化，或者采用其他氨基酸代替谷氨酰胺等均可控制铵的累积。

参考文献：

1.The importance of ammonia in mammalian cell culture；

2.Effectsof Ammonia on CHO Cell Growth, Erythropoietin Production, and Glycosylation；

3.Effectsof elevated ammonium on glycosylation gene expression in CHO cells；

4.Effects of amino acid additions on ammonium stressed CHO cells。