Cell：​CRISPR中的“螳螂捕蝉，黄雀在后”

近年来，CRISPR基因编辑技术发展迅速，其工具种类也愈渐繁多，并广泛应用于基因编辑、基因治疗、核酸定位及核酸检测等领域。

究其根本，CRISPR技术实际上是基于细菌及古菌的免疫防御系统发展而来，这种适应性的针对噬菌体等病毒的免疫防御系统存在于几乎所有的古菌及半数原核生物中。众所周知，生物进化具有协同性，那么，病毒又会发展出什么机制去逃逸CRISPR/Cas系统的清除绞杀呢？

anti-CRISPR（Acr）系统正是噬菌体内应运而生的逃逸机制。

早在2013年Bondy-Denomy等人便发现了Acr系统的存在，作为对宿主内CRISPR/Cas的响应，噬菌体通过编码CRISPR/Cas系统的蛋白抑制剂——Acr蛋白，阻止CRISPR-Cas系统识别异源核酸或抑制其核酸酶活性发挥功能，从而使其基因组可以在宿主细胞中长期存在。并且，后续的研究表明Acr系统普遍存在于许多噬菌体病毒基因组中，显现出极强的序列多样性，也正表明Acr系统是噬菌体与细菌长期协同进化的结果。

在了解CRISPR/Cas系统和anti-CRISPR系统后，我们会发现两者处于一种类似于“螳螂捕蝉，黄雀在后”的关系，那么我们不禁推测：“黄雀”之外，是否还会有“捕鸟者”的存在？

这正是我们今天要解读的文献主题——anti-anti-CRISPR。

不久前，加拿大多伦多大学分子遗传学系的研究人员在国际顶尖学术期刊 Cell 上发表题为：Anti-CRISPR-Associated Proteins Are Crucial Repressors of Anti-CRISPR Transcription 的研究论文。

该研究发现噬菌体中存在一种名为“Anti-CRISPR-Associated Proteins”（抗-CRISPR相关蛋白，简称Aca蛋白）。这是一种普遍存在于Acr操纵子中的DNA结合蛋白，它可以下调Acr基因的转录水平，从而调控噬菌体下游必需基因的表达。这一研究发现或可在基于CRISPR的抗菌技术中体现重要的应用价值。

Acr系统：在噬菌体感染后，Acr基因快速转录表达

为了研究Aca蛋白在调节Acr系统转录的潜在作用，论文研究团队首先评估了噬菌体JBD30感染铜绿假单胞菌PA14过程中Acr基因表达的动力学。在连续时间点的采样后，研究者通过qRT-PCR技术定量了噬菌体JBD30感染宿主后Acr基因的转录水平——在感染后6min内，转录水平增长了100倍。

这项研究表明噬菌体感染后的极短时间内Acr基因便通过强启动子快速转录到一个很高的水平，这种快速转录方式有助于噬菌体在宿主细胞内快速形成Acr系统，从而抵抗宿主的CRISPR/Cas系统的免疫清除。然而，这种“蛮横”的转录方式长期存在，对噬菌体下游基因的转录表达是不利的，甚至最终导致流产感染。

因此，噬菌体必然存在一种调控机制，可以在适当的时间点下调Acr系统的转录表达，即该论文的核心蛋白分子——Aca蛋白。

Aca蛋白：Acr操纵子中编码的普遍存在的DNA结合蛋白

研究团队在先前的研究中，通过生物信息学的预测手段发现：几乎所有的Acr基因位点的下游都会有一段编码螺旋-转角-螺旋（HTH）的DNA结合结构域的基因，这也促使研究者进一步研究发掘这个基因的具体作用，结果表明这个基因正是编码Aca蛋白的基因。

Aca蛋白：抑制Acr基因的转录

在基因层面上，Aca基因与Acr基因密切关联，我们也不难推测Aca蛋白很可能通过HTH结构域结合到Acr基因的启动子序列上，从而调节Acr基因的转录活性。因此，为了确定Aca是否可以与Acr的启动子区域结合，研究者通过电泳迁移率分析实验（EMSA）证实了Aca蛋白可以结合到Acr的启动子区域中的两个反向重复序列——IR1和IR2上。此外，lac Z报告基因检测实验表明Aca蛋白下调了Acr基因的转录水平。

Aca蛋白：消除Acr基因快速转录的危害性

实际上，研究者一开始推测Aca蛋白可以增强Acr基因的转录水平，从而更好地逃逸宿主细胞CRISPR-Cas系统的免疫清除，然而lacZ报告基因检测实验表明Aca蛋白不仅不能增强Acr基因的转录，反而极大地抑制其转录活性。

研究者通过噬菌体突变株JDB30aca1R44A感染实验发现，在Aca蛋白DNA结合结构域失活突变的情况下，噬菌体的感染后病毒滴度下降，即噬菌体的复制能力减弱，与之相对，Aca蛋白其他区域的氨基酸突变则对病毒复制没有明显的影响。

研究者进一步并通过回复突变实验及Acr启动子删除实验证实Aca蛋白的DNA结合结构域对噬菌体复制至关重要。研究者认为这是因为Aca蛋白可以通过结合Acr基因的启动子序列从而下调Acr基因的转录水平，消除Acr基因快速转录对噬菌体复制带来的危害性。

协同进化是自然界的普遍现象，噬菌体为了应对宿主细胞CRISPR/Cas系统的免疫清除而进化发展出Acr系统，这与我们中国的谚语“螳螂捕蝉，黄雀在后”何其相似！

然而在噬菌体中，“黄雀”Acr系统的高水平、快速转录对下游必需基因的表达是不利的，因此需要“驯鸟师”——Aca蛋白的调控，才能形成一个完整完善的Anti-CRISPR系统。

科学永无止境，CRISPR技术虽然在生物医学领域广泛应用，但仍然有许多弊端和不足，很大一部分正源于我们对CRISPR/Cas系统的了解还远远不够。因此，我们不仅要着眼于CRISPR/Cas系统，还要对其他与之相关联的系统有长足的认知，才能让CRISPR/Cas技术更可控、强大及完善！

论文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.07.046