用于高效开发多特异性抗体的原创平台型技术—安升医药的NAPPA平台

作者 l Self Renew

编辑 l 细胞房间

用双特异性抗体直接对接免疫细胞和肿瘤细胞，实现免疫细胞对肿瘤细胞的更精准和更快速的杀伤，已成为癌症免疫治疗的发展热点。目前，同时靶向一个肿瘤细胞靶点和一个免疫细胞激活点的诸多双特异性抗体的开发正如火如荼地进行。然而，有越来越多的研究显示，用更高特异性的多特异性抗体同时激活两个免疫激活点（如CD3加上共刺激因子4-1BB或CD28等）具有显著的治疗优势，能让抗体实现类似CAR-T的癌细胞杀伤效果。但是，多特异性抗体的设计和制备的难度相对双特异性抗体具有明显的提高。现有的多特异性抗体技术平台都需要精细的结构设计，主要原因是这些复杂的分子框架里不同的抗体结构域是紧密耦合的，它们的结构和抗原识别能力会相互受影响。最近发表的Sanofi开发的同时靶向CD38/CD3/CD28的三特异性抗体就是最好的例子，他们在IgG框架的一个手臂上设计了靶向CD3和CD28的抗原识别链，但是这两个识别链的前后位置对抗原结合的影响很大[1]。

为了解决多特异性抗体设计和制备的难题，安升（上海）医药科技有限公司（Assembly Medicine, LLC，简称安升医药）开发了“nucleic acid mediated protein–protein assembly”（简称NAPPA），一种以核酸酶耐受型的核酸介导抗体模块自组装的通用型多特异性抗体制备技术。

▲图1. NAPPA技术的示意图

该技术平台的原理是将作为“靶向模块”的抗体分子（比如scFv）分别偶联到作为“组装模块”的核酸链（左旋DNA）上形成“组装单元”，再通过核酸链之间的互补配对，实现多个抗体分子的组装（如图1）。在近期发表在《Advanced Science》上的文章中，安升医药详细介绍了其NAPPA技术平台的技术细节[2]。

以同时靶向2个CD19和1个CD3的多特异性抗体分子NAPPA001的制备为例。整个NAPPA体系的操作过程可分为“靶向模块”的准备、“组装模块”的设计、“组装单元”的制备以及抗体分子的组装。

“靶向模块”的准备。“靶向模块”即抗体分子，首先在靶向CD19或CD3的scFv分子的C末端引入半胱氨酸突变，用于连接组装模块。随后的表达纯化可采纳常规scFv的表达纯化方法。

“组装模块”的设计。“组装模块”即核酸链，采用的是左旋DNA（因为前人的研究显示，左旋DNA能够抵抗体内多种核酸酶的降解[3]且没有明显的免疫原性[4]）。NAPPA001分子的制备使用了4种提前设计好的左旋DNA序列（且5’端经过氨基修饰）（如图2a）。这4种序列可以实现分子组装所需的互补配对。核酸酶消化实验显示，这4条右旋DNA组装成的四聚体能够耐受DNA酶I、T7核酸内切酶、S1核酸酶以及核酸外切酶I的剪切作用，而以序列相同的右旋DNA构成的四聚体在这些核酸酶的作用下很快降解，显示了左旋DNA的稳定性。

▲图2. 四种左旋DNA链的序列组装成的多特异性抗体NAPPA001

“组装单元”的制备。“组装单元”的制备采用SMCC等双功能连接子，通过化学键偶联的方式桥连核酸5’端修饰的氨基与抗体分子C末端引入的巯基，实现“靶向模块”与“组装模块”之间的稳定偶联。

通过以上流程，他们将抗体蛋白scFvCD19和scFvCD3分别于DNA链偶联，制备了组装多特异性抗体分子所需的“组装单元”：scFvCD19-L-DNA1，scFvCD19-L-DNA2和scFvCD3-L-DNA4（L-DNA3单独使用）。

抗体分子的组装。将包括单独的L-DNA3在内的4种“组装单元”按等摩尔比例混合，组装成能够靶向2个CD19分子和1个CD3分子的多特异性抗体（如图2b）。分子内的“靶向模块”即抗体分子还可以很方便地进行替换，得到靶向性不同的多抗。比如，他们将L-DNA1和L-DNA2上偶联的scFvCD19替换成靶向CEA的scFv，得到NAPPA002分子。

体外的细胞杀伤实验的结果显示，NAPPA001能够促进人源T细胞（分离自人外周血单核细胞hPBMC）对表达CD19的Raji细胞的杀伤（如图3a），且CD25和CD137的表达水平的提高证明NAPPA001确实能够引起T细胞的激活（如图3b）；同样，NAPPA002也能促进T细胞对过表达CEA的结肠癌细胞系LS174T的杀伤（如图3c）。

▲图3. NAPPA001和NAPPA002能够促进T细胞对癌细胞的杀伤

进一步，利用皮下注射Raji细胞构建的免疫系统人源化的移植瘤小鼠模型，他们检测了NAPPA001的体内效果。结果表明，在注射CD19+ Raji细胞时同时注射hPBMC的小鼠的肿瘤生长速率明显小于未注射hPBMC的小鼠，而给予NAPPA001的小鼠的肿瘤生长则在此基础上进一步被抑制（如图4a）。同样，NAPPA002能明显抑制CEA+ LS174T细胞的体内增殖（如图4b）。

▲图4. NAPPA001的体内抗肿瘤效果

另外，给予NAPPA001的小鼠的谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）表达水平相对于未给药的小鼠没有明显的变化，说明NAPPA001对小鼠没有明显的肝毒性；给予NAPPA001的小鼠的体重相对也没有明显的变化。

进一步，公司在NAPPA002分子的L-DNA3上标记荧光探针NHS-Cy5.5，用于检测NAPPA002在体内的代谢情况和对实体瘤的浸润效果。检测结果显示，NAPPA002能够迅速聚集到LS174T来源的实体瘤部位并渗透到肿瘤内部，而在体内随机分布的NAPPA002分子很快被代谢清除（如图5a）。依据荧光定量计算出的NAPPA002分子的体内半衰期约16h（图5b）。

▲图5. NAPPA002对实体瘤的浸润能力和在小鼠体内的代谢情况

通过详细分析，我们可以看出，通过核酸链的互补配对实现蛋白分子多聚体的自由组装的NAPPA平台，是一个可以快速、灵活地制备多特异性抗体的具有通用性的技术。

首先，该技术实现了多特异性抗体内各个单抗结构域的模块化和单个模块的稳定存在，简化了多特异性抗体的结构设计和分子生产，它使得“先期制备各个单抗模块、项目开发时根据需要进行多种单抗的自由组合”的新药研发模式成为可能，使得公司能够迅速跟进新的靶点和新的靶点组合，迅速推进具有临床价值的项目。

其次，该技术是一个具有很强的兼容性的平台型技术。从整个NAPPA结构对“组装单元”数量的容纳性来说，基于核酸链的互补配对的特点，该技术可以较为简洁地实现三特异性、四特异性甚至更高价的抗体的制备，结构设计和分子制备的难度远低于目前常规的融合蛋白技术。

从NAPPA结构对“靶向模块”的内容的兼容性来说，它可以实现各类蛋白的相互组合，可以制备多特异性的抗体或者其他融合蛋白，使得整个结构具有深度优化的空间。比如：公司通过在自由的核酸链（比如NAPPA001和NAPPA002中的L-DNA3）上融合HSA、抗HSA抗体等分子，用于提高整个分子的体内半衰期，使其具备更好的成药性；公司也建立了纳米抗体的酵母表面展示筛选平台，为整个平台提供新型的靶向模块库。纳米抗体分子量小且稳定性高，并且能够在原核细胞内大量表达，生产成本低，是制备靶向模块的理想选择。公司目前正在开发的很多项目都是以纳米抗体为靶向模块。