Cell | 利用FLASH-PAINT多色超分辨率成像可视化复杂的细胞结构

原创 zZ BioArt

撰文 | zZ

可视化细胞的超微结构对于理解细胞功能至关重要。荧光显微镜的发展使得解析细胞内空间结构成为可能。随着光学超分辨显微镜的出现，对细胞内分子的观察可以达到十纳米甚至纳米尺度以下的分辨率。在众多超分辨显微镜中，单分子定位显微镜 (single molecule localization microscopy, SMLM)是常用的细胞生物学研究手段，它包括了利用光物理切换开关的PALM和STORM, 也包括了利用荧光标记短寡核苷酸链互补配对的DNA-PAINT (Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography)【1】。在DNA-PAINT中，感兴趣的目标分子连接着互补链，带有荧光标记的显微探针 (imager) 与该互补链结合，结合后的荧光信号被检测到为一个荧光斑点，并以此成像，分辨率可以达到5纳米以下 (图 1)。

尽管DNA-PAINT与其他超分辨技术相比，分辨率有了显著的提升，但是多色成像技术的不成熟仍是传统DNA-PAINT的短板。一般来说，SMLM中双色成像是主流，三色或四色成像可能会有些挑战。为了优化DNA-PAINT中的多色成像，人们尝试对成像速度进行优化，然而由于DNA序列设计的限制，目前只发现了少数几种优化探针，但是由于每个目标分子都需要特定的探针，这种方法很难扩展到成千上百个探针【2,3】。

近日，来自耶鲁大学医学院的Joerg Bewersdorf团队在Cell上发表了题为Unraveling cellular complexity with transient adapters in highly multiplexed super-resolution imaging的文章。该研究介绍了一种名为fluorogenic labeling in conjunction with transient adapter-mediated switching for high-throughput DNA-PAINT (FLASH-PAINT)的方法。该方法允许在超分辨成像的基础上实现快速的、不受限制的多色成像。

与DNA-PAINT中显微探针直接与目标分子结合相比，FLASH-PAINT的关键在于Transient adapter (TA) 的设计。作者们设计的TA由两个主要序列和分开这两个序列的核苷酸组成，这两个序列可以分别结合目标分子和带有荧光标记的显微探针。为了验证TA的可行性，作者应用DNA折纸技术对TA介导的结合与直接结合进行对比，发现TA介导的结合也是特异、高效并且可逆的。有趣的是，作者用”Y”, “A”, “L”, “E”的DNA折纸结构拼出了YALE, 并证明了TA介导的结合并不影响分辨率 (图 1)。

图 1. FLASH-PAINT的原理以及与传统DNA-PAINT的对比。

另外在传统的DNA-PAINT中，对不同目标分子的成像往往涉及洗掉前一个显微探针并加入新的显微探针，这个清洗并更换的步骤可能需要十分钟，并且多次的清洗可能损坏样品。考虑到这些限制，FLASH-PAINT引入了擦除链 (eraser) 。擦除链可以与前一轮的TA互补配对，防止其结合到对应的目标分子。此时在引入新的TA，便可对新的目标分子进行成像。作者分别用体外和体内试验证明了擦除链的可行性。体外试验中，擦除链基本上可以在98%的程度上擦除TA介导的结合；细胞实验中，引入的擦除链和新的TA可以有效的将荧光信号由线粒体转移至微管。两者都表明擦除链的高效和特异。

为了测试FLASH-PAINT在多色超分辨率成像的应用，作者在U2OS细胞中选取了九个成像靶点，包括了高尔基体蛋白，线粒体蛋白，核蛋白以及双链DNA序列。成像结果显示FLASH-PAINT可以在仅三小时之内完成九个靶点的成像，并且定位精确度可以达到11.2nm. 接下来，为了进一步扩展FLASH-PAINT在细胞成像中的应用，作者选取了三种细胞结构对FLASH-PAINT进行测试：9色FLASH-PAINT成像初级纤毛，13色FLASH-PAINT成像蛋白质分泌系统，3D FLASH-PAINT定量分析细胞器互作。这些实验都表明FLASH-PAINT技术是细胞生物学成像技术的显著进展。

综上所述，通过引入TA和擦除链，这篇文章设计的FLASH-PAINT技术理论上可以达到无限制的多色成像，对于分析细胞超微结构至关重要，具有非常广发的应用价值和极高的应用潜力。

原文链接：

https://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(24)00236-8

制版人：十一

参考文献

1. Jungmann, R., Steinhauer, C., Scheible, M., Kuzyk, A., Tinnefeld, P., & Simmel, F. C. (2010). Single-molecule kinetics and super-resolution microscopy by fluorescence imaging of transient binding on DNA origami. Nano letters, 10(11), 4756–4761. https://doi.org/10.1021/nl103427w

2. Strauss, S., & Jungmann, R. (2020). Up to 100-fold speed-up and multiplexing in optimized DNA-PAINT. Nature methods, 17(8), 789–791. https://doi.org/10.1038/s41592-020-0869-x

3. Chung, K. K. H., Zhang, Z., Kidd, P., Zhang, Y., Williams, N. D., Rollins, B., Yang, Y., Lin, C., Baddeley, D., & Bewersdorf, J. (2022). Fluorogenic DNA-PAINT for faster, low-background super-resolution imaging. Nature methods, 19(5), 554–559. https://doi.org/10.1038/s41592-022-01464-9

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