Mol Cell | 相分离决定大分子定位的验证策略
撰文 | 染色体
大分子在亚细胞中的定位对细胞稳态至关重要【1】。亚细胞区域，如线粒体或内质网，通过生物膜包围，保留大分子。而其他缺乏膜结构的亚细胞区域，如核仁、P小体、Cajal小体、应激颗粒等，被成为“无膜”区域【2】，这些区域的结构形成和维持机制，是一个备受关注的问题。
近日，来自德国马普分子生理研究所的Andrea Musacchio在Molecular Cell期刊发表题为A validation strategy to assess the role of phase separation as a determinant of macromolecular localization（一种评估相分离决定大分子定位的验证策略）的文章。研究提出了一种通用的验证策略，用于评估LLPS在亚细胞区域隔离中的作用。在对染色体乘客复合体（chromosomal passenger complex，CPC）的应用中，发现特定的分子相互作用才是CPC定位的主要驱动因素，而非液-液相分离（Liquid-liquid phase separation，LLPS）作用。
通常情况下，大分子（特别是蛋白质和RNA）通过保守且裸露的界面进行相互作用。在多价蛋白质背景下，同类型大分子的相互作用可以促进无膜介观尺度的区域组装【3】，这种组装通常由LLPS驱动。LLPS驱动的相互作用具有低亲和力和低特异性，导致形成具有液态特性的凝聚物。溶解度决定因子和蛋白质内在无序区域（IDRs）介导的相互作用是LLPS的主要驱动力【4】。对个体细胞活动过程的干预需要极致的特异性【5】。因此，评估特异和非特异相互作用对区域组装的相对贡献至关重要。
CPC的LLPS检测
CPC是一个重要的四亚单位复合物，包含Aurora B激酶、INCENP、Borealin和Survivin。在有丝分裂期间，它定位于着丝粒和着丝粒膜，对细胞功能至关重要。CPC在着丝粒的招募受到靶向模块和催化模块的调控，前者包括Survivin、Borealin和INCENP的N端区域，后者包括Aurora B激酶和INCENP的C端区域。CPC与着丝粒和内部着丝粒膜相互作用，该过程可通过磷酸化标记（H3-T3-P和H2A-T120-P）进行观察。此外，INCENP的碱性片段、Borealin的多功能中段和C端结构域也对其招募起着作用。研究人员利用大肠杆菌共表达了完整的Survivin和Borealin，以及INCENP的前350个氨基酸，构建了重组三聚体CPC-TARG，该结构包含所有靶向着丝粒和着丝粒膜的区域。通过mScarlet标记Survivin片段（mScarletCPC-TARGWT），研究人员成功实现了CPC-TARG的可视化，并发现其在特定条件下发生了LLPS。此外，LLPS的形成受NaCl浓度的影响，降低NaCl浓度可以促进LLPS。进一步研究表明，在细胞质中，LLPS的发生受到非特异性相互作用的影响，这些作用可以通过稀释的大肠杆菌或哺乳动物裂解液得到有效抑制。低浓度裂解液的添加强烈抑制LLPS的形成，随着裂解液浓度的升高，LLPS被完全抑制。这表明裂解液中的成分可能对LLPS的发生具有缓冲作用。这种抑制作用普遍存在于多种细胞裂解液中，揭示了细胞环境对LLPS调控的重要性。LLPS实验通常在使用化学惰性聚合物作为拥挤剂的情况下进行。这些聚合物一般不具备缓冲非特异性相互作用的能力，但可以促进排斥体积效应，从而增强非特异性相互作用的聚集效应。实验结果表明，添加PEG3350或Ficoll400加强mScarletCPC-TARG的LLPS，形成较少但更大的液滴。在结合大肠杆菌裂解液后，虽然裂解液单独抑制了mScarletCPC-TARG的LLPS，但进一步添加PEG3350和Ficoll400则逆转了这一效应，并引发了大量LLPS。
体外LLPS无法准确预测CPC定位
接着，研究人员探讨了体外LLPS模式是否能够预测CPC的定位倾向。他们建立了mScarletCPC-TARG的着丝粒定位分析方法。结果显示，Aurora B的活性对于CPC在着丝粒和着丝粒鞘膜的招募至关重要。抑制Aurora B激酶或者耗竭内源性CPC都会阻止CPC-TARG的定位。因此，评估mScarletCPC-TARG的着丝粒定位倾向需要具有活性的内源性CPC。
为了测试CPC-TARG突变对其定位的影响，研究人员构建了多种突变体复合物。通过比较不同突变体的定位能力，他们发现Survivin与Histone H3和Shugoshin 1的N端结合对于CPC的着丝粒定位至关重要。进一步实验结果表明，Survivin与Shugoshin 1的相互作用对于特定突变（KH/AA）的敏感度较低。然而，虽然突变体在同型LLPS的体外实验中显示出差异，但无法准确预测其在体内的着丝粒定位。随后，研究人员设计了一个带有mScarlet 标签的ISB（INCENP1-58-Survivin-Borealin）结构（mScarlet ISB）。经电转染后，该结构能够被强力招募到着丝点，且其在着丝点的水平高于mScarletCPC-TARGWT。然而，含有DD/AA的ISB突变体未能有效定位到着丝点。LLPS实验显示，mScarlet ISBWT在高盐条件下发生LLPS，而 mScarlet ISBDD/AA只在低盐浓度下发生LLPS。研究指出，CPC-TARG和ISB的LLPS倾向差异是可以预期的，体外LLPS不能准确预测CPC在着丝点的定位。
CPC在体内着丝粒的定位
着丝体组蛋白H3和组蛋白H2A的磷酸化标记可指征CPC的 LLPS成核，为胞质中亚稳态CPC提供线索。研究表明，磷酸标记信号指示LLPS的成核并非通过增加CPC浓度实现。在对细胞进行不同的处理后发现，磷酸标记从着丝粒中清除后，CPC也从着丝粒中消失。活细胞成像显示，Aurora B并非以分离的液滴形式释放，而是溶解在细胞质中。这暗示磷酸标记可能仅是CPC的结合位点，而非成核LLPS的决定因素。然而，关于CPC从着丝粒中释放的具体机制仍需进一步研究。尽管mScarletCPC-TARGKH/AA和mScarletCPC-TARGDD/AA具有与mScarletCPC-TARGWT相同的LLPS倾向，但它们在着丝粒中的定位不佳，可能是因为它们未能与内源性CPC形成的LLPS液滴混合。体外实验显示，这些突变体无法与EGFPCPC-TARGWT混合形成双色液滴。共电转导实验表明，即使在EGFPCPC-TARGWT的存在下，mScarletCPC-TARGKH/AA和mScarletCPC-TARGDD/AA也无法在着丝粒中定位。这表明即使在着丝粒富集后，CPC也不会在其内部发生LLPS。另外，Borealin的C-末端结构域对CPC在着丝粒上的招募至关重要，其缺失会影响CPC的定位。因此，如果LLPS驱动CPC在着丝粒上的积累，那么缺失Borealin C-末端结构域的突变体可能会明显改变LLPS过程。尽管部分突变体，如缺少Borealin C-末端结构域的重组体（mScarletCPC-TARGΔC）在体外LLPS实验中显示出与mScarletCPC-TARGWT相似的行为，但在细胞内定位上，这些突变体着丝粒水平却显著受到影响。因此，Borealin的C-末端结构域对于CPC在着丝粒上的招募是必需的。进一步的实验表明，Borealin中心非结构化片段的缺失也可以阻止LLPS，并减少CPC的着丝粒招募。尽管部分突变体的LLPS倾向受到影响，但LLPS潜力与着丝粒定位之间的关系仍不清晰。这些结果强调了Borealin在调控CPC多重功能中的重要性，但也表明了对LLPS和着丝粒定位之间关系的理解仍需进一步研究。
综上所述，该研究以CPC为例，揭示了特异性相互作用在有丝分裂期间CPC定位中的主导作用，而LLPS的影响并不明显。这一发现不仅有助于理解CPC的作用机制，也说明LLPS在区域组装中的作用具有普遍意义。
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.03.022
制版人：十一
参考文献
1. Blobel, G. (2000). Protein targeting (Nobel lecture). ChemBioChem 1, 86-102. https://doi.org/10.1002/1439-7633(20000818)1:2<86::AID-CBIC86>3.0. CO;2-A.
2. Banani, S.F., Lee, H.O., Hyman, A.A., and Rosen, M.K. (2017). Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 285-298. https://doi.org/10.1038/nrm.2017.7.
3. Mammen, M., Choi, S.K., and Whitesides, G.M. (1998). Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 37, 2754-2794. https://doi.org/10.1002/(SICI)1521-3773(19981102)37:20<2754::AID-ANIE2754>3.0.CO;2-3.
4. Kilgore, H.R., and Young, R.A. (2022). Learning the chemical grammar of biomolecular condensates. Nat. Chem. Biol. 18, 1298-1306. https://doi.org/10.1038/s41589-022-01046-y
5. Musacchio, A. (2022). On the role of phase separation in the biogenesis of membraneless compartments. EMBO J. 41, e109952. https://doi.org/10. 15252/embj.2021109952.
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