氢原子转移（HAT）是化学和生物合成中的一类重要反应。半胱氨酸作为天然氨基酸，其侧链的硫醇基团可参与HAT过程，因此被多种天然酶用于完成合成、代谢及结构修复等生理功能。然而，半胱氨酸的硫氢键（S–H）键能较高，其在反应中形成的硫自由基中间体可能无差别地夺取蛋白质主链或其他位置的氢原子，引发副反应甚至导致蛋白质降解。为避免这一问题，天然酶通常通过复杂的电子传递机制与精细的立体构象来精确调控半胱氨酸自由基的行为，这也使得这类酶结构高度特异、功能单一，难以广泛应用于合成化学中。

为突破这一瓶颈，瑞士巴塞尔大学 Thomas Ward 团队提出设想：苯硫酚的S–H键能远低于半胱氨酸，其相应自由基的氢原子攫取能力也较弱，是否可将其用作辅因子来构建新型人工氢原子转移酶？近日，该团队基于生物素-链霉亲和素技术，通过化学与生物学协同优化策略，成功开发出一种能够高效、高对映选择性催化自由基氢胺化反应的人工氢原子转移酶，拓展了生物催化氢原子转移的反应边界。该成果发表于《美国化学会志》（Journal of the American Chemical Society），文章第一作者与共同通讯作者是曹晖，目前已加入香港科技大学化学系担任助理教授与课题组长。

研究团队首先设计合成了生物素化的苯硫酚辅因子 TP1，其可高效嵌入链霉亲和素（Sav）的结合口袋中、形成人工酶 TP1•Sav。为评估该人工酶的催化性能，该团队选用 Armido Studer 等开发的自由基氢胺化反应作为模型体系。结果显示，基于野生型 Sav 的人工酶活性很低，且无法实现有效手性控制（产率6%，对映体比例 er 为 47:53）。随后，通过对辅因子邻近氨基酸位点进行定向进化，人工酶的性能显著提升。在引入 S112Y、K121W 和 L124F 三个芳香族氨基酸突变后，所得突变体 TP1•Sav S112Y-K121W-L124F 可实现 39% 的产率与 78:22 的 er 值。

图1. 初始反应条件和遗传进化。

为深入理解蛋白质结构与功能之间的关系，研究团队进一步解析了人工氢原子转移酶的单晶结构。结果显示，当辅因子 TP1 与野生型 Sav 结合时，TP1 存在两种不同构象，这解释了为何反应得到近消旋产物。而在 K121W 单点突变体中，TP1 仅呈现单一构象，其硫酚基团与 K121'W 残基的吲哚环之间存在 sulfur‑π 弱相互作用，有效锚定了辅因子，并初步实现了手性控制。在三重突变体 S112Y-K121W-L124F 中，TP1 仍保持单一构象，且与 K121'W 及 L124F 之间形成双重 sulfur‑π 相互作用，进一步稳固了辅因子定位，提高了反应的对映选择性。

图2. X-射线晶体结构

在完成蛋白质层面的定向进化后，该团队进一步通过辅因子工程与反应条件优化对人工酶进行化学优化。他们以进化所得 Sav S112Y-K121W-L124F 为宿主蛋白，系统评估了不同结构的辅因子。在 TP1 的苯环不同位置引入甲基，可精细调控催化中心的空间位阻，其中辅因子 TP5 效果最佳，将 er 值显著提升至 90:10而无需额外定向进化，体现了生物与化学优化的协同效应。将 TP5 的甲基替换为氯或异丙基则导致 er 值降低，说明取代基的电子与空间性质对手性控制具有关键影响。此外，该团队也对反应条件进行了筛选，发现使用罗丹明 6G 作为光敏剂、在 525 nm 光照下引发自由基，可在不影响对映选择性的前提下提高反应效率，使模板反应的产率提升至 70%，er 值保持在 90:10。优化得到的人工酶 TP5•Sav S112Y-K121W-L124F 在多种底物的光诱导自由基氢胺化反应中均表现出良好的活性与稳定性，最高可达到 93:7 的 er 值，展现了较宽的底物适用范围（20个例子，具体见原文）。

图3. 化学优化

机理研究表明，该人工酶在一个催化循环中依次催化两个氢原子转移步骤：苯硫酚自由基从底物1中夺取氢原子，随后苯硫酚分子向自由基中间体pro-3提供氢原子。理论计算分析进一步表明，底物在酶口袋中的结合取向是对映选择性的主要决定因素。

图4. 机理研究

本研究成功构建了一类基于非生物苯硫酚辅因子的人工氢原子转移酶，突破了天然半胱氨酸 HAT 酶在合成应用中的局限性，不仅拓展了生物催化氢原子转移的反应范畴，也为手性胺类化合物的高效合成提供了新平台。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

An Asymmetric Hydrogen Atom Transferase with an Abiological Thiophenol Cofactor

Hui Cao, Kailin Zhang, Vladimir Gorbachev, Tobias Vornholt, Kun Yu, Dongping Chen, and Thomas R. Ward

J. Am. Chem. Soc., 2025, 147, 41600–41609, DOI: 10.1021/jacs.5c12516

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