1953年，英国剑桥大学科学家、诺贝尔奖获得者沃森和克里克揭示了DNA双螺旋结构，开启了生命科学新时代。60年后，剑桥大学Shankar Balasubramanian教授团队发现了人类基因组中的非经典四链结构—G-四链体（G4），为DNA研究提供了全新视角。G4是一种非经典DNA二级结构（图1a），广泛分布于基因组中，尤其富集于癌基因启动子等转录调控区域。研究表明，G4在基因表达调控和癌症等疾病中发挥关键作用。深入解析G4调控机制，不仅有助于揭示基因调控新原理，也为G4靶向药物和精准治疗策略的开发提供依据。然而，G4在活细胞中的形成与转录过程高度动态，理解其在转录中何时形成及如何精确参与调控，亟需一种具备高时空分辨率的可逆调控策略，这是当前G4研究面临的关键挑战之一。

近日，英国剑桥大学二代测序发明人、皇家科学院院士、爵士Shankar Balasubramanian教授研究团队在国际著名期刊Nature Chemistry 发表研究论文，开创性地报道了一种全新的光控小分子开关—G4switch，该开关分子能够在蓝光（405 nm）和绿光（525 nm）照射下被“打开”和“关闭”，从而以高时空精度可逆靶向调控DNA G-四链体（G4）结构，实现精准控制G4参与的基因表达和癌细胞增殖。这一突破为G4功能研究提供了全新工具，并为未来的精准医学与光控治疗策略奠定了基础。该研究的第一作者是来自英国剑桥大学化学系的张小昀博士。

图1. G4switch介导的光控基因表达机制示意图。

G4switch的概念设计与表征

研究人员构思设计了一种构型依赖性G4结合的小分子光控开关，命名为 G4switch。该分子在弯曲的顺式构型为“关”，伸展的反式构型为“开”，并设想在不同可见光照下能实现转换的两种构型对G4 DNA表现出显著不同的结合能力。研究人员推测，只有在“开”的反式构型下，G4switch才能高选择性地靶向DNA G4结构，并在活细胞中有效抑制相关基因的转录，从而实现对G4依赖性基因表达的时空精准调控（图1b）。

图2. G4switch的设计、合成与筛选。

基于上述思路，研究人员设计了G4switch探针，将两个已知G4配体的关键结合基团——来源于pyridostatin（PDS，蓝色）和吡啶-2,6-二羧酰胺（PDCs，红色）——通过一个性质明确的光异构化基团diazocine（青色）连接起来（图2a–c）。考虑到G4配体通常依赖平面芳香骨架与G四联体之间的π-堆积作用，研究人员设想，在拉伸的反式构型下，G4switch更接近平面结构，因而更有利于与G4结合；而在弯曲的顺式构型中，则不利于形成有效的π-堆积，从而大大降低结合能力。

为筛选合适的光控配体，研究人员合成了一系列候选G4switch分子（1–10）（图2c）。所有化合物均通过“Lipinski五大法则”评估，都具有较好的理化性质，理论上具备良好的细胞通过性。研究人员还通过氢谱核磁共振光谱验证了这些分子的光开关性能，显示在405 nm和525 nm光照下可实现快速、可逆的光异构化。

研究人员通过荧光插入剂置换（FID assay）实验评估了这些分子对G4结构的结合亲和力和选择性。结果显示，化合物9为最优分子，其反式异构体的表观解离常数（K_d）为0.46 ± 0.02 µM，而顺式异构体的K_d则低一个数量级，为4.97 ± 0.26 µM（图2d,e）。此外，化合物9对双链DNA（dsDNA）几乎没有结合（图2f）。综上所述，化合物9是最有效的光开关G4配体，展现出最高的405 nm光依赖的G4选择性结合。

G4switch在体外能可逆稳定G4结构

图3. G4switch光依赖性G4结合的体外表征。

接着，为了评估配体9结合稳定G4结构的能力，研究人员通过圆二色谱（CD）光谱法对9与已知G4 DNA寡核苷酸G4 KIT1和G4 MYC进行滴定实验。在没有离子稳定G4结构的含Li⁺条件下，未加入9的G4 KIT1的CD光谱呈现出明显平行G4拓扑结构的特征峰：~240 nm处的负峰和~260 nm处的正峰（图3a）。随着无光照激活的顺式-9的逐渐加入，G4 KIT1的CD光谱几乎没改变（图3a,c），但在405 nm原位光照射下，G4特征峰的椭圆度显著增加，表明反式-9能显著稳定G4结构（图3b）。对于G4 MYC，405 nm光激活的反式-9使~273 nm正峰移至~260 nm，并增强了~240 nm处负峰的椭圆度（图3e），表明9诱导稳定平行G4的形成，而顺式-9基本不具备这种效应（图3d）。值得一提的是，9在经至少10次蓝绿光开关循环后，未表现出任何效率损失（图3f），确认了9其作为可光开关G4配体的高效性。

G4switch细胞内对基因组上G4结构的光依赖结合

图4. G4switch在人类细胞中的全基因组结合位点分析

进一步，研究人员评估了化合物 9 是否能在细胞内以光依赖的方式结合基因组上的 G4 结构。采用 Chem-map 技术，该方法利用带有生物素标记的小分子将转座酶 Tn5 招募至小分子在染色质上的结合位点，标记邻近的 DNA，进而通过高通量测序分析鉴定结合位点（图4a）。研究人员合成了生物素化探针 G4switch-biotin（图4b）。结合实验验证显示，生物素化基本不影响 G4switch 的光依赖的 G4 亲和力和选择性。随后，在有无 405 nm 光照条件下，研究人员分别在通透处理的 U2OS 细胞中进行 Chem-map 实验。结果显示，光激活的反式-9 能结合基因组上的 16,310 个高置信度位点，而顺式-9 仅结合 5,422 个，且几乎全是前者的子集（图4c-e），这一结果与其体外 G4 结合实验结果一致（图2d,e）。将反式-9 的结合位点与 G4-seq 检测到的潜在 G4 形成位点比对，发现高达86%（13,979/16,310）重叠（图4e）；同时，有高达 80% 的结合位点也与 G4-CUT&Tag 映射的 17,306 个内源性 G4 形成区域一致（图4f）。综上，结果表明光激活的反式-9 能高效、特异性地结合细胞内的 G4 DNA 结构，而顺式-9 结合弱很多。

活细胞中基因表达的可逆光调控

图5. G4switch在活细胞中光学调控转录

鉴于基因启动子中 G4 的形成与基因转录活性密切相关，而 G4 稳定小分子可能通过干扰转录机器或转录因子的结合来调节基因表达。因此，研究人员进一步评估了光活化的化合物 9 是否能够在活细胞中通过靶向 DNA G4 来调节基因表达。

研究人员使用 RNA 测序 SLAM-seq 方法定量化转录组的即时变化（图5a），U2OS 细胞在不同光照条件下处理 9（6 μM，30分钟），并进行 SLAM-seq 分析。结果显示，光激活的反式-9 显著下调了 311 个基因的表达（fold change >2，q < 0.05），其中 87%（270/311）基因含有 Chem-map 测到的反式-9 结合位点。相比之下，无光照激活的顺式-9 仅影响了 61 个基因，且具有较弱的 Chem-map 结合信号（图5b）。非常有意思的是，约 68%（210/311）反式-9 下调的基因的下调表达可以通过连续 405 nm 光激活和 525 nm 光去激活过程完全恢复，表明化合物 9 具有可逆调控含 G4 形成的基因表达的能力。

此外，已有研究表明 G4 选择性小分子通过稳定 DNA G4 可抑制基因表达，并在癌细胞中具有良好的抗癌细胞增殖效果。为探究化合物 9 的空间选择性地控制癌细胞增殖潜力，研究人员在同一 6 孔板中处理 U2OS 细胞并通过遮光处理只对部分区域施加 405 nm 脉冲光照，结果表明只有在 9 和光照同时存在时，细胞增殖显著抑制（相对存活率 < 40%）(图5c,d)。进一步证明光激活的 9 通过诱导 DNA 损伤应答实现抗增殖，但没有直接引起细胞死亡的表型。以上结果说明了化合物 9 在细胞中实现光调控的空间选择性抗增殖效应。

总结

英国剑桥大学张小昀博士等研究人员独辟蹊径的开发了一种细胞可渗透的小分子 DNA G4 结合分子 G4switch（9），该分子能够通过可见光可逆调控 G4 结构。在体外进行生物物理表征后，研究人员通过细胞基因组集合位点的全局分析验证了 G4switch 对 G4 靶标的光依赖性结合。进一步，在活细胞实验中，G4switch 展现了对含 G4 基因表达和细胞增殖的高时空控制精度。此研究提供了一种化学工具，能够直接研究细胞内关键生物过程的动态变化，并具有潜在的医学转化前景，尤其是在靶向 G4 的癌症治疗策略开发方面。

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Optical control of gene expression using a DNA G-quadruplex targeting reversible photoswitch

Xiaoyun Zhang, Somdutta Dhir, Larry Melidis, Yuqi Chen, Zutao Yu, Angela Simeone, Jochen Spiegel, Santosh Adhikari & Shankar Balasubramanian

Nat. Chem., 2025, DOI: 10.1038/s41557-025-01792-1

（本文作者：贺选）