捕捉BlsE底物自由基中间体，深入理解自由基SAM脱水酶/脱氢酶反应机理

自由基SAM (S-adenosyl-L-methionine, S-腺苷甲硫氨酸) 酶是自然界一大类以四铁四硫簇（[Fe₄S₄]）为活性位介导自由基反应的酶超家族。目前已知的、属于这一大类金属蛋白酶家族的自由基 SAM 酶的总数已经超过了80多万种。其催化循环始于单电子由还原性的铁硫簇转移到SAM，引发SAM分子中碳硫键的均裂，从而产生高度活泼的5′-脱氧腺苷自由基（9，5'-dAdo•）和甲硫氨酸（Met）。产生的脱氧腺苷自由基 (5'-dAdo•) 在不同的自由基 SAM 酶中，会根据个别酶不同的催化功能，进而与酶特定的底物发生后续的化学反应。自由基SAM酶能够催化的反应类型非常广泛，因为相对于双电子的反应而言，自由基反应的能垒普遍较低。该特点使得自由基SAM酶能够促进惰性键的活化、从而达成骨架重排、偶联反应等复杂的化学转换过程。

以自由基SAM酶 BlsE 为例，该酶在杀稻瘟菌素 (blasticidin S) 的生物合成途径中扮演了一个非常重要的角色。BlsE 的功用是催化底物CGA (1) 的脱水反应，生成的产物是 2。根据早前的机理研究推测，4′-α-羟烷基自由基 (10) 可能为CGA脱水反应途径中的一个中间体。该机理与另外一个催化糖类脱水反应（3 → 4）的自由基SAM酶AprD4的机理类似，均是非氧化还原介导的脱水反应，达成消除邻位的羟基。此外，自然界中的两个自由基SAM脱氢酶, BtrN 和 DesII, 其催化反应路径也是经由类似的α-羟烷基自由基中间体。但与脱水酶不同的是，该自由基中间体会进一步通过失去一个电子完成脱氢反应 (5 → 6 和 7 → 8)。由此可见，在自由基SAM酶的催化反应过程中，即使是相似的自由基中间体，也可以经由截然不同的反应途径形成不同的产物。然而，自由基中间体是如何产生的，以及后续不同反应途径是如何决定的，人们对于这些基本问题的了解和认识，目前仍然十分有限。

先前的研究曾运用电子顺磁共振（electron paramagnetic resonance, EPR）对脱氢酶 BtrN和 DesII 催化反应过程中产生的α-羟烷基自由基进行了表征与分析 ^[1]。结果显示该自由基电子自旋密度所在的 p-轨道，与邻位的羟基呈近交叉（clinal）的几何构型，不利于邻位羟基的离去，因此发生脱氢反应。由此推测，底物自由基的构型，可能是决定后续反应路径的重要指标。然而，对于自由基SAM脱水酶催化过程中产生的的自由基中间体，一直缺乏相关的报道和研究。最近，南方科技大学的陶丽芝教授和美国德州大学奥斯汀分校的刘鸿文教授课题组成功捕捉到了脱水酶BlsE-E189A催化CGA (1) 反应过程中产生的α-羟烷基自由基中间体 (10)。通过氘代底物以及相应的EPR表征与分析，研究者发现该自由基中间体的结构与脱氢酶BtrN和DesII的自由基中间体结构相似。而且，与此前分析相吻合的是，此BlsE突变型能够同时催化底物CGA (1) 的脱水与脱氢的反应 (10 → 12)，且若将离去基团由羟基替换为更易离去的氨基或者氟取代基，则可使消除反应占优势。另一方面，CGA的差向异构体产生的底物自由基p-轨道，虽与邻位羟基呈重叠式构型 (periplanar)，却无法发生脱水反应。结合这些实验结果，研究者提出对于消除反应而言，相比于自由基中间体的构型，离去基团的稳定性，是更为重要的一个决定反应途径的关键因素。相较于脱水酶AprD4通过氨基酸残基的氢键网络稳定离去的羟基，从而促进消除反应，BlsE则缺乏关键的氢键网络 ^[2]。但是根据BlsE的晶体结构，以及相应的理论计算表明，在CGA (1) 的脱水过程中，C3′-OH的离去与C4′-OH的去质子化协同发生，而谷氨酸E189通过与C3′-OH形成氢键，同样有效促进了脱水的反应 ^[3]。因此，在BlsE-E189A的反应中，脱水这一步骤受阻，使得其他反应途径 (如脱氢) 能够有效地与其竞争。该研究加深了我们对于自由基SAM脱水酶/脱氢酶反应机理的理解，也有助于发展此类自由基酶更为多样的反应性。

该工作近期发表在Journal of the American Chemical Society 上 ^[4]，陶丽芝教授课题组的研究生马百旭和刘鸿文教授课题组的博士后李渝萱为共同第一作者，陶丽芝教授和刘鸿文教授为共同通讯作者。

相关文献：

[1] Ruszczycky, M. W.; Liu, H.-w. (2015) Mechanistic enzymology of the radical SAM enzyme DesII. Isr. J. Chem. 55, 315–324, 10.1002/ijch.201400130.

[2] Liu, W.-Q.; Amara, P.; Mouesca, J.-M.; Ji, Xi.; Renoux, O.; Martin, L.; Zhang, C.; Zhang, Q.; Nicolet, Y.  (2018) 1, 2-Diol dehydration by the radical SAM enzyme AprD4: a matter of proton circulation and substrate flexibility. J. Am. Chem. Soc. 140, 1365–1371, 10.1021/jacs.7b10501

[3] Lee, Y.-H.; Hou, X.; Chen, R.; Feng, J.; Liu, X.; Ruszczycky, M. W.; Gao, J.-M.; Wang, B.; Zhou, J.; Liu, H.-w. (2022) Radical S-adenosyl methionine enzyme BlsE catalyzes a radical-mediated 1, 2-diol dehydration during the biosynthesis of blasticidin S. J. Am. Chem. Soc. 144, 4478–4486, 10.1021/jacs.1c12010.

[4] Ma, B.; Lee, Y.-H.; Ruszczycky, M. W.; Ren, D.; Engstrom, A.; Liu, H.-w.; Tao, L. (2025) EPR characterization of the BlsE radical offers insight into the determinants of reaction outcome that distinguish radical SAM dioldehydratases from dehydrogenases. J. Am. Chem. Soc. in press, 10.1021/jacs.4c13307.