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化学O-ADP-核糖基化反应:以NAD+为原料合成ADP-核糖精准修饰的多肽与蛋白质

注:文末有本文科研思路分析


ADP-核糖基化是一种极具功能多样性的翻译后修饰(PTM),它在各种生理和病理过程中发挥着至关重要的作用,涉及病原与宿主互作,DNA损伤修复,癌症发生和神经系统疾病等诸多方面。近日,河南师范大学李凌君教授团队以商品化的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)为原料,设计了化学O-ADP-核糖基化反应,实现了对天然的多肽/蛋白的ADP-核糖基化后修饰。

图1. 化学O-ADP-核糖基化反应及其合成ADP-核糖基化多肽/蛋白质。图片来源:Angew. Chem.


生物体内天然存在的ADP-核糖基化的动态可逆性,使得直接从生物样本中获得具有精准化学结构的ADP-核糖基化多肽和ADP-核糖基化蛋白质非常困难。为此,研究者付出大量的努力发展化学合成ADP-核糖基化多肽及蛋白的方法。但是,由于ADP-核糖基化的多肽同时包含了复杂的核苷结构单元和多肽结构单元,而且标准的多肽固相合成方法不能与核苷酸合成方法很好的兼容。因此,目前合成ADP-核糖基化多肽及蛋白通常需要从构建α-糖苷键的氨基酸残基入手,通过复杂的保护基策略和苛刻的焦磷酸化反应来实现,反应步骤繁琐,总收率低。迄今为止,尚未有能利用天然多肽和NAD+为原料的化学方法开发出来。


在该研究中,作者设计了化学O-ADP-核糖基化反应,将包含各种功能基团的伯醇和仲醇类化合物立体选择性地连直接连接到ADP-核糖基团上。随后,作者利用醇类化合物上的炔、烯等官能团,设计了click和光促Thiol-ene等生物缀合反应,将ADP-核糖基链接至多肽或蛋白质特定的氨基酸残基,简单方便地对多肽/蛋白质进行位点可控的ADP-核糖化。在该方法中,他们首次实现了直接以NAD+为原料,高达94%的收率、88:12至99:1的α:β异构体比例以及可逆转的构型立体选择性获得目标产物。

图2. 32种离子液体促进的NAD+与醇亲核取代反应的筛选。图片来源:Angew. Chem.


通过所发展的高效化学O-ADP-核糖基化反应,作者首先简化了合成具有生物活性ADP-核糖基化多肽和蛋白的现有方法。荷兰的Filippov教授课题组建立从头合成ADPr-炔丙基的方法。他们利用Vorbrüggen型核糖基化反应构建α-糖苷键,然后进行磷酸化、焦磷酸化,通过多步反应路线,以19%总收率和71:29的α:β异构体比例得到目标化合物。相比之下,本文方法使用市售的NAD+一步生产ADPr-炔丙基,产率为89%,α:β异构体比为97:3。该反应无需苛刻的反应条件,可以在普通的生物化学实验室完成。利用该O-ADP-核糖基化反应,合成ADP-核糖基化蛋白质的过程也可被大大简化。作者利用炔丙醇的O-ADP-核糖基化产物在标准点击化学条件下直接与42-叠氮化物修饰泛素进行反应,顺利得到ADP-核糖基化泛素蛋白,并通过质谱、ADP核糖和泛素的特异性抗体验证了产物结构。

图3. 利用化学O-ADP-核糖基化反应制备ADP0核糖基化多肽。图片来源:Angew. Chem.


进而,作者将该方法用于在未做化学修饰的天然多肽和蛋白质上进行ADP-核糖基化。通过NAD+与包含末端烯基的醇类化合物反应,作者以79%–91%的收率获得了ADP-核糖基化烯丙醇型产物。进而,他们又发展了针对ADP-核糖基化烯丙醇于半胱氨酸的光促Thiol-ene反应,以定量收率获得目标产物。随后,利用化学O-ADP-核糖基化反应和光促Thiol-ene反应的联用,作者实现了对各种包含半光氨酸残基多肽的直接ADP-核糖基化;并通过Cysteine突变及上述两个反应,在大肠杆菌表达的泛素蛋白质上实现了定点ADP-核糖基化。作者通过这种两步反应,将ADP-核糖基团修饰到多肽/蛋白质上的方式为获取ADP-核糖基化工具提供了一种新思路和新方法:通过将需修饰的位点突变为半胱氨酸,再与ADPr-烯丙基反应即可。

图4. 利用化学O-ADP-核糖基化反与光促Thiol-ene反应实现以NAD+和天然多肽/蛋白质为原料合成ADP-核糖基化精准修饰的多肽/蛋白质。图片来源:Angew. Chem.


此外,作者还利用O-ADP-核糖基化反应研究了ADP-核糖基化多肽与Macrodomain蛋白识别的构效关系,发现了T-型和S-型两类与Macrodomain mH2A1.1具有高亲合力的α-ADP-核糖基化多肽和β-ADP-核糖基化多肽。


这一成果近期发表在Angewandte Chemie International Edition 上,文章的第一作者是河南师范大学博士研究生尤延博,通讯作者是李凌君教授和朱安莲教授。


原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):

Chemical O-ADP-Ribosylations: Synthesis and Bioconjugation of ADPr-Peptides/Proteins from NAD+

Yanbo You, Anlian Zhu, Dongshuang Fan, Honglei Wang, Lingjun Li

Angew. Chem. Int. Ed., 2025, DOI: 10.1002/anie.202418321


科研思路分析


Q:这项研究最初是什么目的?或者说想法是怎么产生的?

A:如上所述,我们的研究兴趣是开发能够用于探索生物体内ADP-核糖基化过程的化学生物学工具。众所周知,生物体内天然存在的ADP-核糖基化的动态可逆性,使得直接从生物样本中获得具有明确化学结构的ADP-核糖基化多肽和ADP-核糖基化蛋白质非常困难。本篇工作积累借鉴了实验室之前的经验,发现NAD+可以作为良好的底物来接受各种亲核基团的进攻;经过尝试,不同的醇能够与NAD+进行高效反应,而且得到ADP-核糖基化小分子中一部分可以通过生物缀合反应与多肽蛋白质偶联。这为方便的获取ADP-核糖基化分子工具提供了一种新思路。


Q:研究过程中遇到哪些挑战?

A:本项研究中最大的挑战是如何找到合适的ADP-核糖基类似物与多肽偶联,得到ADP-核糖基化肽的方法。在这个过程中,老师和同学们共同努力,也借鉴了文献中报道的蛋白质之间化学偶联的方法,通过不断地尝试,最终成功得到了ADP-核糖基化多肽,将这种方法延伸至与蛋白质偶联,最后也取得了不错的结果。这种将ADP-核糖基化类似物通过化学反应一步偶联的过程简化了ADP-核糖基化多肽/蛋白质的制备。


Q:该研究成果可能有哪些重要的应用?哪些领域的企业或研究机构可能从该成果中获得帮助?

A:ADP-核糖基化修饰可以改变蛋白质的活性、稳定性和配体结合能力,对细胞功能产生重大影响。ADP-核糖基化就像一把双刃剑,它参与调控诸如核酸损伤修复、神经退行等众多生理过程与疾病过程,然而细菌利用单-ADP核糖化防御病毒侵染,也用来对抗宿主免疫系统,甚至作为细菌毒素攻击真核宿主细胞关键分子,在细胞中产生灾难性的后果。我们希望提供一种新的方法降低获取ADP-核糖基化分子工具的难度,从而促进对ADP-核糖基化研究的进展。


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