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针对三阴性乳腺癌干细胞的核壳结构载体介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统及疏水性药物共递送

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近日,西浦慧湖药学院丁大伟课题组与苏州大学药学院张学农课题组等合作,在药剂学领域国际顶级期刊Journal of Controlled Release上在线发表了题为“针对三阴性乳腺癌干细胞的核壳结构载体介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统及疏水性药物共递送”(Core-shell vector-mediated co-delivery of CRISPR/Cas9 system and hydrophobic drugs against triple-negative breast cancer stem cells)的研究论文。图片

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背景


三阴性乳腺癌(TNBC),一种雌激素受体、孕酮受体和人表皮生长因子受体2 (HER2)表达均为阴性的乳腺癌亚型,具有异质性高、侵袭性高、预后差等特点。化疗对TNBC等速生瘤有较好的疗效。然而,临床应用化疗具有毒副作用大、耐药性高,肿瘤易复发和转移等缺陷,因此迫切需要开发针对TNBC的有效治疗策略。越来越多的证据表明,化疗疗效受限归因于癌症干细胞(CSCs)。CSCs是一类以自我更新和自我分化为特征的特殊肿瘤细胞群体,与肿瘤发生、发展、转移和药物耐受密切相关。研究者已经开发出分化治疗,分子靶向治疗和靶向纳米技术等方法用于针对CSCs的治疗。然而,在肿瘤微环境中,非csc可以转化为CSCs,从而导致TNBC的不完全治疗。我们的前期研究成果证明,使用 CRISPR/Cas9 技术敲低 FBXO44 蛋白表达可显著抑制 TNBC 的增殖、复发和转移。此外,文献报道 FBXO44 表达下调降低了 CSCs 的 CD44+CD24− 表型。因此,通过靶向 FBXO44 基因将 TNBC 的 CSCs 逆转为正常肿瘤细胞,并将其与化疗联合使用可能是治疗 TNBC 的有效策略。



方法与意义


在该研究中,他们设计了一种共递送CRISPR/Cas9基因编辑质粒及化疗药物阿霉素(DOX)的智能纳米平台,应用于TNBC的肿瘤干性重编程及与化疗的联合治疗。该核壳结构纳米粒具有包封率高、靶向性强以及安全性高等特点。具体地,聚醚酰亚胺-硫辛酸共聚物(PL)被选为核心材料,通过二硫键交联的疏水性硫辛酰环包封疏水性药物DOX 应用于化疗。接下来,带负电荷的FBXO44 基因编辑质粒通过静电相互作用被吸附到上述阳离子载体上。最后,通过界面聚合法将生物相容性透明质酸 (HA) 包覆在 NP 外层(DOX-PL/pFBXO44)(图1A)。这不仅可以屏蔽带正电荷的 PL 的毒性,还可以通过与过表达的 CD44 受体结合增强肿瘤靶向特性。

系统给药后,由于被动和主动靶向,大量 nDOX-PL/pFBXO44 在肿瘤中积累。同时,HA 壳在肿瘤微环境中被过表达的透明质酸酶 (HAase) 解离。暴露的 NP 正电荷促进内吞作用。DOX-PL/pFBXO44 依靠PEI 的质子海绵效应实现溶酶体逃逸。然后,肿瘤细胞内高水平谷胱甘肽 (GSH)促使纳米粒核心解体,进而释放基因编辑质粒pFBXO44和 DOX。pFBXO44 可以在基因组水平上有效地进行 CRISPR/Cas9 系统介导的 FBXO44 编辑和阻断,将 CSCs 转化为正常癌细胞,以抑制肿瘤的发展和复发。同时,持续的肿瘤干性重编程与快速杀伤肿瘤细胞的 DOX 有效互补,实现 CRISPR/Cas9 介导的 TNBC 基因治疗和化疗的协同作用(图1B)。

鉴于疏水性小分子药物和核酸药物的多样性(如 miRNA、mRNA 和 siRNA),我们推测本课题开发的智能壳核纳米系统在治疗各种癌症和其他疾病(如类风湿性关节炎)方面的应用将更加广泛。

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图1. (A) nDOX-PL/pFBXO44 的制备过程示意图。(B)尾静脉注射后 nDOX-PL/pFBXO44 递送过程及 TNBC 的治疗机制示意图。



数据与结果


我们采用去溶剂法制备负载DOX的PL纳米粒,研究 DOX 与 PL 重量比(DOX/PL,w/w%)用于优化DOX 负载能力。当二者重量比分别为 15 % 和 20 % 时,共聚物表现出良好的 DOX 包封率(>90 %)(图 2A)。重量比为20%时,粒径小于 150 nm,并有良好的 PDI(图 2B),此外载药量约为24.6%。该比例被用于后续纳米粒制备和应用。负载pDNA后,琼脂糖凝胶电泳显示出很好的质粒包封效果(图2C),ζ电位提高,而且粒径也因为电荷作用导致的压缩而减小。随后,将修饰的HA聚合在纳米粒表面(nDOX-PL/pFBXO44)。粒径有所增大,表面电荷也由正转负(图 2E、F)。TEM照片显示nDOX-PL/pFBXO44外观为球形,并呈现明显的核壳结构(图2G)。在体外条件下,其中DOX释放呈现良好的HAase及GSH依赖性(图2H),有利于在肿瘤微环境中响应性释放,减少毒副作用。

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Fig. 2. (A) EE% and LE% at various weight ratios of DOX to PL. (B) Particle size and PDI of DOX-PL at various weight ratios of DOX to PL (wDOX/wPL%), n =3, mean ±SD. (C) Gel retardation assay of DOX-PL/pFBXO44 at various weight ratios (wpFBXO44/wDOX-PL). (D) Particle size and zeta potential of nPL at different mHA: PL ratios, n =3, mean ±SD. (E) Size distribution histogram of different NPs, (F) Zeta potential of different NPs, n =3, mean ±SD. (G) TEM image of DOX-PL/pFBXO44 and nDOX-PL/pFBXO44. Scale bars: 200 nm. (H) In vitro release of DOX from nDOX-PL/pFBXO44 NPs at different conditions, n =3, mean ±SD.


载药纳米粒被肿瘤细胞摄取后,激光共聚焦实验显示其分布在溶酶体。4小时后,标记pDNA的绿色荧光与溶酶体的红色荧光逐渐分离,显示出依赖于PEI的质子海绵效应的溶酶体逃逸能力(图3A)。然后,我们通过增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达验证了和商用试剂Lipo2000相当的pDNA转染效率(流式细胞分析及共聚焦显微镜)(图3B-E)。分子水平验证发现FBXO44基因被编辑(效率为18.1%),相应的蛋白质表达显著降低(图3F、G)。在体内实验中,该基因编辑显著下调了FBXO44蛋白表达,并明显降低了肿瘤细胞的干性,即CD44及ALDH1的表达(图4A-D)。结合化疗,nDOX-PL/pFBXO44 引起了肿瘤细胞的明显凋亡(图4E)。通过动物体重等试验,也验证了该纳米载体无明显的毒副作用(图4F)。总之,本研究通过基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的TNBC肿瘤干细胞重编程,达到了智能药物递送及协同增强化疗并减少毒副作用的目的。

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Fig. 3.(A) Confocal imaging of the intracellular distribution of pFBXO44 labeled with MFP 488 in MAD-MB-231cells after treatment with nPL/pFBXO44MFP488 at 1 and 4 h, respectively. The lysosomes were stained by LysoTracker Red. Scale bars: 20 μm. (B) Fluorescence intensity distribution curve, (C) statistics of transfection efficiency, and (D) mean fluorescence intensity statistics in MAD-MB-231 cells after transfection with various formulations. (E) Confocal images of MAD-MB-231 cells transfected with different formulas for 48 h. Scale bar: 200 nm. (F) Mutation frequency analysis of different treatment MAD-MB-231 cells by T7EI assay. (G) FBXO44 and Cas9 protein expression levels with different formulations treatment in MAD-MB-231 cells by Western blot assay. (For interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)

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Fig. 4. (A) Immunohistochemical staining of the CD44, ALDH1 in tumor mass after 12 days of different treatments. The mean fluorescence intensity of (B) CD44 and (C) ALDH1 via ImageJ software (n =5, ns means not significant, ***P <0.001, ****P <0.0001). Scale bar: 100 μm (D) FBXO44 protein expression levels in tumors of various treatments by Western blot assay. (E) H&E and TUNEL staining images of the tumor in each group on day 18. Scale bar: 100 μm. (F) Body weight of tumor- bearing mice in each group throughout drug administration. Statistical significance was calculated via one-way ANOVA with Tukey’s multiple comparisons test.



全文链接


https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168365924009179   


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供稿:丁大伟

新媒体:周子悦

监制:张济



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