尹航组Nat. Chem. Biol.：揭开长期寻找的酪氨酸泛素化的面纱

注：文末有陈国强院士、刘磊教授评述

2025年1月6日，清华大学药学院尹航课题组在Nature Chemical Biology 杂志上发表了研究论文，开发了Fusion E2-Ub-R74G Profiling （FUSEP）技术，首次确认酪氨酸泛素化在多种重要人源蛋白中的存在，并提供了一种易用的系统化工具，用于研究赖氨酸和非赖氨酸泛素化修饰。

蛋白质泛素化是一种重要且复杂的一种细胞调控方式，在信号传导、免疫反应和癌症发展中发挥关键作用。然而，长期以来，泛素化被认为主要发生在赖氨酸（lysine）上，几乎与赖氨酸泛素化画上等号。科学家一直在推测和寻找酪氨酸（tyrosine）上是否也存在泛素化，但一直没有明确的证据支持，这可能受限于此种修饰难以用传统方法进行捕捉，细胞中是否存在酪氨酸泛素化也成为一个长期未解的谜题。近些年，苏氨酸（threonine）和脂多糖（LPS）等非赖氨酸泛素化研究的证据被发现并报道，学术界逐渐形成共识，赖氨酸泛素化可能仅是泛素化修饰的冰山一角（图1） ^[1-6]。

图1. 代表性的蛋白质泛素结合方式，从左至右分别为已知的赖氨酸（Lysine）泛素化、丝氨酸（Serine）泛素化、苏氨酸（Threonine）泛素化和未知的酪氨酸（Tyrosine）泛素化。

实现E2特异泛素通路的氨基酸级精准解析

泛素化修饰是由通过泛素激活酶E1、泛素结合酶E2（超过30种）、泛素连接酶E3（超过600种）依次参与完成的一种高度复杂的级联反应，统称为总泛素通路。根据E2酶的种类，该通路可进一步细分为多个E2特异的子通路（图2）。E2酶通常决定了泛素的结合方式，包括异肽键（赖氨酸lysine）、氧酯键（丝氨酸serine/苏氨酸threonine）或者硫酯键（半胱氨酸cysteine）。因此，E2酶是开发泛素化研究工具的理想切入点。如今已知约30种的E2通路，形成了一个有益的研究框架。然而，尽管近年来非赖氨酸泛素化的研究取得一定进展，相关的研究工具和检测技术仍然相对匮乏，这为深入探索泛素化修饰的多样性和生物学功能带来了挑战。

图2. 总泛素通路（Cellular ubiquitome）可进一步根据E2酶细分为超过30种的E2子通路（E2-specific ubiquitome）。

为了解决当前技术瓶颈，研究者通过理性设计，开发了FUSEP（Fusion E2-Ub-R74G Profiling）技术。这一技术专门针对非赖氨酸泛素化的独特化学特性，优化了质谱样品制备、检测和分析方法。通过FUSEP技术，研究者成功揭示了酪氨酸泛素化在多个重要人源蛋白上存在的面纱，如SKP-CUL1-F-box（SCF）E3酶复合体的成分CUL1和CAND1、线性泛素链组装复合体LUBAC的成员HOIL1和HOIP，以及O-GlcNAc糖基转移酶OGT等蛋白的多个位点。这一发现为深入理解泛素化的多样性和机制提供了重要线索。

FUSEP策略的核心在于设计了一种含有Ub-R74G点突变的特异探针，能够在活细胞中原位标记E2酶的底物蛋白。通过质谱胰酶消化后，该探针可在修饰位点留下特异的LGGG残基，从而与内源性泛素修饰产生的GG残基区分开来（图3）。这一技术结合高精度质谱分析，不仅可以解析传统赖氨酸泛素化，还能通过羟胺（NH₂OH）处理消除非赖氨酸泛素化修饰，从而揭示了E2酶（如UBE2D3和UBE2Z）在细胞内的非赖氨酸泛素化功能。

图3. E2-Ub-R74G探针经质谱胰酶消化后形成LGGG残基，与内源泛素修饰留下的GG残基区分，可精确到具体氨基酸位点。

FUSEP技术的开发为研究E2特异泛素化通路提供了一种前所未有的工具，能够实现氨基酸级分辨率的精准解析。这一技术不仅推动了对赖氨酸和非赖氨酸泛素化的理解，还为揭示酪氨酸泛素化的分子机制及其潜在生物学功能奠定了重要基础。

揭示酪氨酸泛素化的神秘面纱

在人类细胞中，研究者通过FUSEP技术首次揭示了一种新型的翻译后修饰——酪氨酸泛素化——在多个重要蛋白的多个位点上的存在。比如SCF E3复合体为例，FUSEP揭示了CUL1蛋白在多个位置上，尤其是其高度保守的99号位点酪氨酸残基上发生了酪氨酸泛素化，这一发现得到了内源泛素（GG）修饰的酪氨酸残基数据的支持（图4）。这一新发现表明，与传统的赖氨酸泛素化相比，酪氨酸泛素化在调控CUL1活性方面可能展现出潜在独特的化学和生物学特性。这一发现进一步验证了FUSEP作为一种有效工具的价值，该技术能够在原位深入研究E2特异的赖氨酸和非赖氨酸泛素化连接方式，为扩展对泛素结合方式——泛素生物学中的核心问题——的理解提供了新的视角。

图4. （左）CUL1蛋白Y126位点的泛素残基GG修饰谱图 ;（右）不同CUL1蛋白的泛素化条带比较：CUL1-Y99、CUL1-F99（缺乏形成氧酯键的羟基）和CUL1-K99（酪氨酸突变为赖氨酸），其中CUL1-F99呈现较低的泛素化（HMW CUL1）对无泛素化（neat CUL1）比值。

FUSEP的开发为酪氨酸泛素化——当前几乎完全未知——的研究开辟了新的可能性。这一发现促使人们思考酪氨酸泛素化是否具有独特的生物学功能和分子机制，同时为解决因检测工具匮乏而长期未解的科学难题提供了新的动力。由于非赖氨酸泛素化的化学稳定性较低且生物学功能尚未完全明确，相关研究一直处于探索阶段。然而，正如2022年Nature Chemical Biology中的展望文章“A new dawn beyond lysine ubiquitination” ^[5]、2024年Nature Structural & Molecular Biology的评论文章“Just how big is the ubiquitin system?” ^[6]、2024年2月刊的Nature Structural & Molecular Biology关于泛素化的专题“Understanding writers and readers of ubiquitylation” ^[7]所讨论的，随着技术的进步，未来这一领域有望吸引不同技术背景和专长的科研人员共同推进其发展。

简便易用的质粒转染与探针电转方法，适用于多种实验场景

FUSEP技术经过系统优化，旨在实现简便易用，适用于典型细胞、分子生物学及生物化学实验平台。该技术能够方便地将探针编码至传统的分子生物学过表达载体中，便于后续序列改造：（1）对于易转染的细胞（如常见细胞系），可以通过经典的质粒转染方法进行探针的过表达，操作与常规细胞表达方法接近，包括细胞培养和转染步骤。探针表达仅需使用标准的20种氨基酸。（2）对于较难转染细胞（如THP-1细胞），可以采用电穿孔技术进行蛋白探针的导入。此外，蛋白探针还可应用于裂解液中的FUSEP鉴定，进一步扩展了应用范围。

揭示单次跨膜E3蛋白在细胞焦亡中的潜在作用

除了上述发现，研究者还利用FUSEP技术深入研究了单次跨膜E3蛋白RNF149与UBE2D3的配对，探讨其在细胞凋亡过程中对斑点样细胞凋亡相关蛋白（ASC）泛素降解的影响。通过shRNA稳定敲低RNF149的THP-1细胞系，研究者观察到ASC蛋白水平显著上升，进而影响了细胞焦亡过程。近年来，细胞膜上的单次跨膜E3蛋白因其在细胞膜上对抗体等干预手段的优势，以及其相对独特的序列和底物特异性，吸引了包括AbTAC、PROTAB在内的技术开发。然而，关于其调控机制和下游底物的系统研究仍较为缺乏。该发现不仅为深入理解细胞凋亡的分子机制提供了新的视角，也为未来的潜在治疗应用开辟了新的可能性。

小结

总体而言，FUSEP技术为研究酪氨酸（tyrosine）泛素化提供了全新的视角和必要的工具。酪氨酸泛素化长期以来未得到明确证实，主要由于其在细胞中的化学特性使得传统的检测方法难以捕捉。FUSEP通过精确的探针设计和优化的质谱分析，首次揭示了酪氨酸泛素化在多个关键人源蛋白上（CUL1、CAND1、HOIL1、HOIP和OGT）的存在，尤其在SCF E3复合体中的CUL1蛋白上，发现了酪氨酸泛素化修饰。该技术不仅为酪氨酸泛素化的分子机制提供了的研究工具，也推动了非赖氨酸泛素化研究的进展。FUSEP技术的简便易用和高灵敏度，使其成为探索复杂泛素化修饰的一种有效方法，有望在未来的研究中发挥重要作用，进一步深化对泛素化修饰多样性及其生物学功能的理解。

该论文两位作者是清华大学药学院沈思奇和尹航（通讯）。该研究得到了国家自然科学基金、卫健委基金、北京市自然科学基金、清华-北大生命科学联合中心、北京高等学校卓越青年科学家计划等项目的资助。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

E2–Ub-R74G strategy reveals E2-specific ubiquitin conjugation profiles in live cells

Siqi Shen & Hang Yin 

Nat. Chem. Biol., 2024, DOI: 10.1038/s41589-024-01809-9

专家点评

陈国强 院士（海南医科大学）：

尹航教授团队开发了被称为FUSEP的新策略，以识别活细胞中各类泛素（ UB ）缀合物。在此基础上，他们揭示了一种全新的翻译后泛素化修饰方式——酪氨酸泛素化，可能为肿瘤治疗提供新的潜在靶点。在多种癌症的发生和发展过程中，酪氨酸泛素化与磷酸化共同调控细胞的增殖、分化和存活。另一方面，酪氨酸泛素化作为一种新型的调控机制，可能在肿瘤细胞中发挥独特作用。FUSEP技术能够在活细胞中高精度解析酪氨酸及其他非赖氨酸泛素化修饰，具有广泛的应用潜力。通过识别和解析关键的泛素化修饰位点，FUSEP有望为早期诊断、监测及个体化治疗提供新的潜在工具。

刘磊 教授（清华大学化学系） ：

泛素化学生物学工具的发展对泛素生物学的深入研究具有重要价值。FUSEP技术为蛋白质泛素化修饰的研究，特别是非赖氨酸泛素化，提供了一种新的化学生物学工具。长期以来，泛素的研究主要集中在赖氨酸修饰上，而非赖氨酸泛素化的探索相对滞后。导致这一情况的因素主要是非赖氨酸泛素化独特的化学性质和细胞内复杂修饰的鉴定难度，使得传统方法难以有效捕捉和分析。FUSEP技术通过带有Ub-R74G点突变的特异探针，克服了这一问题的瓶颈，首次揭示了酪氨酸泛素化修饰的存在，特别是在SCF E3复合体的CUL1蛋白上，发现了酪氨酸残基的泛素化。这一进展为非赖氨酸泛素化的研究提供了不同的视角，潜在推动了相关领域的进一步探索与发展。

该技术通过结合质谱分析，使得对特定残基上功能性非赖氨酸泛素化修饰的阐明变得更加可行，展现了独特的优势。FUSEP技术不仅优化了质谱样品制备和分析方法，而且其探针改造的灵活性和简便易用性为不同背景的研究者提供了便捷的工具参考。特别地，FUSEP为深入理解酪氨酸泛素化的分子机制提供了必要的研究工具，同时也为未来探索基于非赖氨酸泛素化的生物学功能奠定了基础。随着泛素化生物学领域的不断进展，特别是在化学生物学技术的持续发展和跨学科团队的共同努力下，未来有望深入揭示复杂泛素化修饰，尤其是非赖氨酸泛素化的分子机制和生物功能，为疾病治疗和转化研究提供新的思路。

参考文献：

1. Pao, K.C. et al. Activity-based E3 ligase profiling uncovers an E3 ligase with esterification activity. Nature 556, 381-385 (2018).

2. McClellan, A.J., Laugesen, S.H. & Ellgaard, L. Cellular functions and molecular mechanisms of non-lysine ubiquitination. Open Biol 9, 190147 (2019).

3. De Cesare, V. et al. Deubiquitinating enzyme amino acid profiling reveals a class of ubiquitin esterases. Proc Natl Acad Sci U S A 118 (2021).

4. Otten, E.G. et al. Ubiquitylation of lipopolysaccharide by RNF213 during bacterial infection. Nature 594, 111-116 (2021).

5. Squair, D.R. & Virdee, S. A new dawn beyond lysine ubiquitination. Nat Chem Biol 18, 802-811 (2022).

6. Lechtenberg, B.C. & Komander, D. Just how big is the ubiquitin system? Nat Struct Mol Biol 31, 210-213 (2024).

7. Understanding writers and readers of ubiquitylation

https://www.nature.com/nsmb/volumes/31/issues/2