JMC | 海龟抗菌肽结构优化及提高抗菌肽稳定性的常见结构改造策略比较

英文原题：Improving the Stability and Anti-Infective Activity of Sea Turtle AMPs Using Multiple Structural Modification Strategies

通讯作者：王义鹏 (中国科学院烟台海岸带研究所)

作者：Zifan Ye^# (叶子凡), Zhouye Xu^# (徐州业), Jianhong Ouyang^# (欧阳建红)，Wenzhuang Shi (石文状), Shuangyu Li (李双宇), Xu Wang (汪旭), Binjuan Lu (路宾娟), Kang Wang (王慷)

背景介绍

微生物耐药性的快速上升已成为全球公共健康的重大威胁，预计到2050年耐药微生物感染每年可能导致1000万例病人死亡。为了应对这一挑战，开发新型抗菌药物迫在眉睫。抗菌肽（AMPs）作为具有潜力的下一代候选抗菌药物，因其直接杀菌能力和免疫调节功能受到广泛关注。然而，大多数天然AMPs因结构不稳定、毒性和生理条件限制等缺点不适于临床应用。天然AMPs的结构改造成为近些年研究热点之一。对于天然AMPs稳定性差这一问题，目前已有多种针对性的结构改造策略，如氨基酸序列调整、关键氨基酸残基替换、非天然氨基酸替换、分子环化和订书肽等。但是，对于这些不同结构改造策略的优缺点还不清楚。

本研究以绿海龟来源的α-螺旋型抗菌肽Cm-CATH2为模板，设计了一系列衍生肽，通过序列截短、氨基酸替换、分子环化和订书肽等策略改造其结构，评估不同改造策略对其稳定性、抗菌活性、抗炎活性及毒性的影响。结果表明，序列截短（NCM4）有效保留了Cm-CATH2的最佳活性区域，L-鸟氨酸替换（oNCM）显著增强了稳定性并改善了药物开发潜力，而其他策略则存在不同的局限性。

文章亮点

针对绿海龟来源的天然抗菌肽Cm-CATH2，系统性应用了多种结构改造策略（包括序列截短、D-氨基酸替换、L-鸟氨酸替换、L-高精氨酸替换、二硫键环化和订书肽设计），综合比较了不同修饰策略对抗菌肽稳定性、抗菌谱、抗炎活性、生物膜抑制能力以及抗菌机制的影响，提供了不同策略的优劣势分析。结果表明oNCM 在体外和体内均表现出优异的安全性和抗菌活性，且对细菌耐药性的诱导能力显著低于传统抗生素，具有良好的临床开发前景。

工作详解

作者首先对绿海龟抗菌肽Cm-CATH2进行截短以确定其最佳活性片段，并对截短肽的抗菌活性、溶血性和细胞毒性进行分析比较。通过从N端和C端逐步截短生成的NCM1-10和CCM1-10衍生肽（图1A），发现适度截短（如NCM1-6和CCM1-6）可显著增强抗菌活性，MIC几何平均值低于母肽；而过度截短（NCM7-10和CCM7-10）则导致活性下降甚至丧失（图1B）。溶血活性分析显示所有肽对人红细胞的溶血率低于5%，但细胞毒性测试表明部分肽对哺乳动物细胞（如4T1、B16-F10）存在较高毒性（图1C-D）。在综合抗菌活性、抗炎活性和细胞毒性后，NCM4被认为是最优模板，用于后续结构改造。

图1. 截断Cm-CATH2序列，以确定最佳活性片段

作者随后以NCM4为模板，进行多种化学修饰（包括L-鸟氨酸替换、L-高精氨酸替换、D-氨基酸替换、二硫键环化和订书肽设计等）并研究对其抗菌活性、溶血性和稳定性的影响。结果显示，L-鸟氨酸替换（oNCM）和D-氨基酸替换（dNCM2）显著增强了肽的蛋白酶和血清稳定性（图2D-G），同时保持良好的抗菌活性（图2A-B）和低溶血性；二硫键环化肽（dsNCM1）也具有一定的稳定性和抗菌效果，但效果取决于环化位点的选择。相比之下，某些修饰（如hRNCM和部分订书肽）表现出较高的溶血性或较差的稳定性，表明修饰策略需谨慎设计。整体上，oNCM、dNCM2、dsNCM1以及母本肽NCM4在活性与安全性之间取得最佳平衡，是理想的候选肽。

图2. 多策略修饰NCM4以增强其稳定性

为了进一步筛选出最佳改造肽，作者综合研究了修饰肽（oNCM、dNCM2、dsNCM1、NCM4）的抗菌活性、抗生物膜活性、抗菌机制、体内外安全性和体内抗感染效果。在大部分实验中oNCM均表现出优于其他3种修饰肽的结果，或者与之相当。尤其在小鼠急性毒性实验评估修饰肽的体内安全性实验中，oNCM表现出最低的急性毒性和对肝肾功能的良好安全性，优于其他修饰肽和阳性对照药多黏菌素B。这些结果表明，修饰肽特别是oNCM在活性、稳定性和安全性之间取得了最佳平衡，具有良好的临床开发潜力（图3）。

图3. Cm-CATH2改造流程、活性评价与机制研究概括图

总结与展望

文章总结了通过多种结构修饰策略优化天然抗菌肽Cm-CATH2的研究成果，指出截短肽NCM4在抗菌活性和安全性方面表现最佳，而L-鸟氨酸替换（oNCM）进一步增强了肽的稳定性并保持较低毒性，成为理想的候选肽。研究分析了不同修饰方法的优缺点，揭示了抗菌肽多重作用机制（如膜破坏、DNA结合和ROS生成）的协同作用。总之，未来的抗菌肽设计应以优化生物活性为核心，同时结合合理的化学修饰以提高稳定性，并系统评估其安全性。该研究为抗菌肽的临床应用开发提供了重要的设计思路和技术支持，有望助力解决微生物耐药性带来的全球健康挑战。

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Improving the Stability and Anti-Infective Activity of Sea Turtle AMPs Using Multiple Structural Modification Strategies

Zifan Ye, Zhouye Xu, Jianhong Ouyang, Wenzhuang Shi, Shuangyu Li, Xu Wang, Binjuan Lu, Kang Wang, Yipeng Wang*

J. Med. Chem. 2024, 67, 24, 22104–22123

https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.4c02039 

Published December 5, 2024

© 2024 American Chemical Society

通讯作者信息

王义鹏，中国科学院烟台海岸带研究所研究员，博士生导师。主要从事天然药用多肽/蛋白发掘、药用多肽/蛋白设计改造和应用、多肽与天然免疫研究。发表SCI论文70余篇，包括以通讯作者发表 Nat Commun (2024a, 2024b), Med Res Rev (2024, 2022), J Med Chem (2024, 2023, 2022, 2018a, 2018b), Small (2023), J Biol Chem (2015)和ACS Infect Dis  (2020)等论文40余篇，ESI高被引论文2篇，总被引用2600余次，被引超过100次论文6篇，单篇最高被引290余次（Google Scholar）。获授权国家发明专利70余项。主持国家自然科学基金（3项）和江苏省重点研发计划等项目10余项。入选中国科学院人才引进计划、福建省高层次人才、江苏省高校“青蓝工程”优秀青年骨干教师、厦门市“双百计划”领军型创业人才、黄河三角洲地区引进急需人才、苏州市高等院校、科研院所紧缺高层次人才等。担任Trends Biotechnol., Med. Res. Rev., Research, eLife, J. Med. Chem., Cell Rep. Phys. Sci., Mol. Ecol., Arch. Toxicol.和J. Nat. Prod.等SCI期刊审稿人。

第一作者信息

叶子凡，苏州大学药学院博士研究生二年级，主要从事抗菌机制，抗菌肽构效关系研究。以第一作者的身份在Nature Communications、Journal of Medical Chemistry发表两篇论文，以共同第一作者在Small、Bioorganic Chemistry发表两篇论文。

（本稿件来自ACS Publications）