绿色溶剂Anisole/NOP结合新型缩合剂TBEC在固相多肽合成中的应用

多年来，开发可以广泛应用于工业生产的多肽合成绿色溶剂是学术界和工业界共同的目标之一。近期的系列研究已提出了一些更环保的“可持续”溶剂，包括2-甲基四氢呋喃（2-MeTHF）、四氢呋喃（THF）、环戊基甲醚（CPME）、γ-纤维内酯（GVL）、N-甲酰吗啉（NFM）、碳酸丙烯酯（PC）、1,3-二甲基-2-咪唑烷酮（DMI）、N-丁基吡咯烷酮（NBP）、4-甲基四氢吡喃、碳酸二甲酯（DMC）、环戊酮和二丙二醇二甲醚（DMM）等（图1）。然而问题也随之而来，部分绿色溶剂无法有效溶解所有N-保护氨基酸，部分绿色溶剂粘度较高（例如NBP），影响使用。

图1. SPPS中常见的可持续性和绿色溶剂。

将溶剂混合使用，是解决单体溶剂问题的一种潜在方案。溶剂混合物的物化性质可能比单一成分更适合于固相多肽合成（SPPS）。根据GSK绿色溶剂指南，苯甲醚（anisole）是最常用的溶剂之一，可以从可再生材料如木质素中获得，是一种经济、环保、安全、可生物降解的化合物。同样，对异丙基甲苯（p-Cymene）由于可以方便地从天然来源的柠檬烯中获得，也被认为是一种绿色溶剂。不过，这两种化合物都具有相对较低的介电常数和偶极矩，这可能会阻碍溶解性。

图2. 苯甲醚与对异丙基甲苯化学结构。

为解决这一问题，意大利萨勒诺大学的研究人员使用苯甲醚或对异丙基甲苯与其它绿色溶剂，如乙酸乙酯、乙醇、丁醇和N-辛基吡咯烷酮（NOP），测试了混合溶剂在固相多肽合成中的应用。此外，他们还使用N-tert-butyl-N’-ethylcarbodiimide（TBEC）作为绿色缩合剂，并结合5-(ethylthio)−1H-tetrazole（ETT）作为添加剂。相关研究成果近日发表在Green Chemistry Letters and Reviews 上。

图3. 相关试剂的化学结构。

为了测试绿色溶剂的性能，研究人员分别进行了氨基酸溶解性测试、树脂溶胀测试、Fmoc脱保护动力学测试，以及氨基酸缩合过程中的消旋化测试。溶解性测试显示，Anisole/NOP（N-辛基吡咯烷酮）（75:25）的混合物能够溶解所有的Fmoc保护氨基酸。然而COMU和Oxyma在此混合溶剂中溶解度较低，因此研究者选择了TBEC/ETT缩合剂。树脂溶胀性试验中，研究者选择了不同类型的树脂，包括聚苯乙烯（PS）、聚乙烯醇（PEG）交联的聚苯乙烯树脂，如TentaGel（TG）和100% PEG树脂ChemMatrix（CM）。结果显示，TG树脂在Anisole/NOP中的溶胀度低于DMF，而PS树脂在两种溶剂中的表现相似。另一方面，CM树脂在Anisole/NOP中的溶胀度高于DMF（图4）。因此使用CM树脂在Anisole/NOP中进行的SPPS符合绿色化学要求。由于CM树脂已经停止生产，因此研究者选择PS进行进一步研究。图5展示了Fmoc-Val-OH在20% piperidin/Anisole, NOP (3:1) 的液相色谱图，显示了令人满意的Fmoc脱保护动力学。

图4. 不同树脂在DMF和Anisole/NOP (3:1) 的溶胀度对比。

图5. Fmoc-Val-OH 脱Fmoc液相色谱图（T0黑色，T2min紫色，T4min蓝色）。

外消旋化是肽合成中的一个常见副反应，与氨基酸、缩合剂和溶剂高度相关。研究者选择了非常容易发生外消旋化的氨基酸Phg作为底物，测试Fmoc-Phg-Pro-NH₂二肽的合成过程。表1 显示了不同方案的外消旋程度。在 DMF 中的合成，消旋度非常低（试验1，3）。而无论是在室温还是在微波下，在Anisole/NOP（3:1）中合成的二肽没有发生消旋化。

表1. Fmoc-Phg-Pro-NH₂ SPPS在不同缩合条件下的外消旋化副反应程度。

随后，研究者选择了五肽 Aib-enkephalin (H-Tyr-Aib-Aib-Phe-Leu-OH/NH₂) 作为底物测试anisole/NOP (3:1) + TBEC/ETT 体系在SPPS中的具体表现。由于目标序列存在两个难以完全缩合的Aib 残基，因此该底物可以很好地用来评估这种合成手段的有效性和通用性。在这个研究中，目标产物Aib-enkephalin 的合成采用微波辅助合成，在不同SPPS条件下进行了反应。不同SPPS条件下的结果见表2。

表2. Aib-enkephalin在不同SPPS条件下的合成结果。

与在标准溶剂 DMF（试验1）中进行的合成相比，在 Wang PS 树脂上使用anisole/NOP（试验2 和 3）合成的五肽的纯度最高。使用 TBEC/ETT 作为缩合剂，使用 Rink-Amide PS 作为树脂（试验6）副反应的百分比低于在 DMF 中进行的合成（试验 4）。考虑到这些结果，试验3 和 6 可以作为进一步优化的基础。在另外一个十肽底物H-Val-Gln-Aib-Aib-Ile-Asp-Tyr-Ile-Asn-Gly-OH/NH₂的合成对比试验中，anisole/NOP在Rink-Amide PS 树脂上的合成获得了最高的纯度（试验4），相对于标准化SPPS（试验3）明显提高（表3），同时在绿色化学应用和粗品纯度方面得到了保障。

表3. H-Val-Gln-Aib-Aib-Ile-Asp-Tyr-Ile-Asn-Gly-OH/NH₂多肽的SPPS结果对比。

综上，研究者确定了anisole/NOP作为绿色溶剂与TBEC/ETT缩合剂组合的应用价值，为绿色多肽合成增条了一种可用的选择。

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Application of a new green protocol in solid-phase peptide synthesis: identification of a new green solvent mixture compatible with TBEC/ETT

Giovanni Vivenzio, Maria Carmina Scala, Giulia Auriemma, Carla Sardo, Pietro Campiglia, Marina Sala

Green Chem. Lett. Rev., 2024, DOI: 10.1080/17518253.2024.2404234

（本文由北纬55°供稿）