师法自然！剑桥大学Nitschke组合成迄今最大封闭空腔笼

自组装可以从简单基元构建复杂的生物功能性结构，如病毒衣壳和铁蛋白笼，这些笼状结构使用许多相同的亚基铺砌在一个多面体的表面上。大部分球状病毒衣壳由五聚体和六聚体的重复单元自发地自组装而成，衣壳大小可以根据其中装载“货物”的不同而改变。具有Goldberg多面体几何形状及二十面体对称性的衣壳通过在其五边形结构基元之间增加六边形基元，同时保持五边形间的二面角不变来增加其衣壳大小。为了包裹大分子客体或模拟病毒结构，研究者总是期望获得大尺寸、高核数的配位笼，但热力学控制的组装过程具有熵不利的劣势，而且组装过程中纠错的困难会导致分子笼的构筑存在很大的不确定性。由简单基元组成的大尺寸、大空腔配位笼的可控自组装仍然面临着巨大的挑战。

近日，英国剑桥大学Jonathan Nitschke课题组（2012年英国皇家化学会Cram Lehn Pedersen 超分子化学奖、2022年International Izatt-Christensen Award获得者 ^[1]）设计了罕见的基于吡咯的五臂配体，利用次级组分自组装策略，发展了与组装病毒衣壳不同的新策略，系统地构筑了尺寸及空腔逐渐增大的配位笼，突破了笼封闭空腔的瓶颈，并得到迄今为止具有最大良好封闭空腔的配位笼，有助于阐明更大、更复杂和功能性笼的构造原理、助力药物研发及生物大分子冷冻电镜结构解析。相关工作发表于期刊Nature Synthesis，第一作者为吴凯博士。

自组装是一种在生物和合成领域中利用简单基元构建复杂、功能性结构的强大工具。例如，自组装形成的病毒衣壳可以封装和保护基因物质直到其传递。相比于编码一个足够大的单一蛋白作为衣壳，多个较小的亚基可以自发地自组装成为衣壳，其尺寸可以根据载荷大小而变化。根据遗传经济学原则，近似球形的二十面体对称性空腔具有最大的体积-表面积比率，从而最大程度地减少所需的蛋白质数量。具有二十面体对称的病毒衣壳通常由“三角剖分数”（T）描述。生物进化不仅优化了衣壳的对称性，还发展出通过增加T值，来不断增大空腔，以容纳更大、更复杂的病毒基因组的组装策略（图1a）。Caspar和Klug提出的“准等效原理”奠定了理解病毒如何建造越来越大衣壳的基础。虽然小的衣壳可以保持高对称性，但较大的衣壳需要亚基以一种变形的方式相互作用。这些亚基不再完全相同，五边形和六边形亚基可以形成更接近于球形的Goldberg多面体结构。具有Goldberg多面体几何形状及二十面体对称性的病毒衣壳通过在其12个五边形结构基元之间增加六边形基元，同时保持五边形间的二面角不变来增加其衣壳大小。然而，模仿二十面体对称性的病毒衣壳自组装需要一个复杂且极具困难的异配体组装策略（通过五连接和六连接配体自分类实现）。作者另辟蹊径，发展了一种利用五连接的次级组分以同配体方式组装更大笼的替代策略，并通过改变多面体笼中五边形之间的二面角θ来实现（图1b）。该二面角的系统变化类似于改变病毒衣壳大小的“突变”，进而逐步形成更大的分子笼。

受病毒衣壳和许多其他生物组装体的启发，合成化学家已经制备了具有规则形状和限域空腔的纳米分子笼。合理控制由简单成分组成的离散、大尺寸、具有空腔的配位笼的自组装仍然极具挑战。与自然界中广泛存在的构成二十面体病毒衣壳顶点的五边形结构基元相比，具有五重对称性的结构基元非常罕见，因为获得这些基元的合成困难。目前为止，只有很少基于corannulene或calixarene的结构基元来组装得到二十面体或十二面体构型的分子笼。作为一个简单的五连接的结构基元，吡咯骨架的刚性和平面性使其非常适用于作为多面体自组装结构中五边形的面，因此作者设计了基于五连接的吡咯骨架的次级结构单元A（图1），并利用Nitschke课题组发展的次级组分自组装策略来构建不同几何结构和尺寸的分子笼。

图1. (a) 由五边形和六边形亚基组装而成、逐渐增大的具有二十面体对称性的病毒衣壳。(b) 通过次级组分A组装的M_5nL_2n系列笼的金属核数N 随着五边形之间的二面角（θ）的增加而逐渐增加；灰色箭头代表导致θ 和N 增加的系统变化。（十二面体1和2对应于具有T = 1病毒衣壳的Goldberg结构）。图片来源：Nat. Synth.

作者设想，五连接的胺A将与吡啶甲醛B或C发生亚胺缩合，形成五臂的双齿配体，并进一步与具有八面体配位几何构型的金属离子结合，形成具有M_5nL_3n分子式的结构。该配体也可以与具有四面体配位几何构型的金属离子结合，形成M_5nL_2n的结构。另外，A还可以与醛D或E结合，形成五臂的三齿配体，它可以进一步与具有八面体配位几何构型的金属离子配位，同样形成M_5nL_2n结构。这些结构的形成都将由最大位点占有率原则驱动，即所有金属离子都是配位饱和的，所有配体的氮原子都与金属配位。

其中，对于具有M_5nL_3n分子式的结构，十二面体（N = 20，n = 4，图1b）是Goldberg衣壳结构系列中最小的。病毒通过在五边形之间增加六边形亚单位，同时保持五边形之间的二面角不变来增加衣壳的大小，与病毒不同的是，作者通过调节这个关键的二面角来增加分子笼的大小。对于M_5nL_2n系列的结构，随着笼的核数（N，笼的金属中心数量）从较小的截端四面体（图1b中的3）增大到最大的截半二十面体Icosidodecahedron（5），五边形面之间的二面角θ也会增加。鉴于这种相关性，作者发展了一种独特的策略来增加θ，以增加M_5nL_2n结构分子笼系列的大小，例如通过增加金属离子配位数，以及通过增加配位基团附近位阻、配体的齿数和柔性（图1b）。

由组分A、2-吡啶甲醛B和具有八面体配位几何构型的过渡金属组装的笼状结构，应采用M_5nL_3n分子式（N = 20，n = 4，图1b）。作者利用这些次级组分与Fe(NTf₂)₂组装得到了十二面体Fe₂₀L₁₂分子笼，Fe-1。然而，弱的质谱信号和非常宽的核磁氢谱限制了进一步的详细分析。作者推测形成十二面体结构所需的几何构型与低自旋态二价铁配位的规则八面体配位球之间不匹配，这就导致Fe-1稳定性较低。为了匹配形成十二面体结构所需的配位中心的几何构型，作者试图通过引入立体位阻，使用具有大位阻的甲基的次级组分C来调节Fe金属离子的第二配位球（图1b）。位阻的引入降低了二价铁配合物低自旋态的稳定性，但有利于形成高自旋配合物，同时核磁信号也可以分布在更大的范围内。通过位阻的引入调节配位构型，作者成功选择性地得到了十二面体构型的Fe₂₀L₁₂分子笼Fe-2。该结构的形成通过核磁、质谱进行了证实。

图2. 十二面体构型的分子笼Co-2的自组装及核磁、质谱和单晶结构表征。图片来源：Nat. Synth.

当用Co(NTf₂)₂代替铁盐时，核磁氢谱和质谱证明形成了与上述Fe-2同构的十二面体Co₂₀L₁₂分子笼Co-2，通过T1弛豫时间测试及Solomon方程（氢原子和顺磁性FeII中心之间的距离关系）可以分别对笼配体的质子进行归属（图2）。通过单晶X射线分析作者证实了该十二面体分子笼的结构，该结构的直径约为5 nm。MoloVol程序计算出空腔体积为13,132 Å³（图4a, c）。超高真空低温扫描隧道显微镜也可以观测到单个笼状分子的尺寸约为5 nm，与单晶结构一致。

作者推断，使用具有四面体配位构型的一价Cu离子进行组装，可能会形成Cu₃₀L₁₂截半二十面体结构。然而，却得到了较小的Cu₁₀L₄截端四面体Cu-3（N = 10，n = 2，图1b）。导致形成较小分子笼的原因可能是四面体构型的一价Cu离子能够容忍五边形面之间较小的二面角，避免了形成较大结构的熵值成本。

为了得到最大的截半二十面体结构，作者接下来使用具有八面体配位几何构型的金属离子，同时使用三齿配体来替换双齿配体（图1b）。为此，作者使用能够与五胺A形成三齿配体臂的邻菲罗啉醛D，来代替B进行自组装。质谱证明形成了化学式为Co₁₅L⁶的Co-4的结构（图1b），Co-4具有截端菱形体的几何结构，五边形在顶点之间的二面角约为80°（图4）。近似D3对称性的Co-4结构，具有三种不同对称性的Co金属顶点和五个不同的配体臂环境。

作者接下来寻求增加配体的柔性，即引入一个更柔性的亚组分E，来实现截半二十面体结构的构筑。作者推断，醛D中更刚性的邻菲罗啉环可能有利于容纳截端菱形体Co-4中较小的二面角（80°），而柔性更大的联吡啶醛E可能使这一角度扩大到截半二十面体结构所需的理想的117°，其更规则的结构将消除形成不太规则的Co-4所带来的熵不利的因素。作者通过次级组分结构的这一微小变化——在自组装中用更柔性的组分E取代刚性组分D——成功组装得到了Zn₃₀L₁₂截半二十面体结构Zn-5。这一结构的形成通过核磁、质谱及扩散序谱（DOSY）进行了证明。作者还通过小角X射线散射（SAXS）分析，获得了进一步的结构信息。SAXS曲线与单分散核壳球体模型的密度函数非常吻合，对应于一个内径为2.26 nm、壳厚为1.07 nm的空心球状笼（图3），这与DOSY测量结果及模型尺寸都吻合。MoloVol计算得到的空腔体积为36,415 Å³。

图3. 截半二十面体构型的分子笼Zn-5的自组装及核磁、质谱和小角X射线散射结构表征。图片来源：Nat. Synth.

为了进一步扩大这些分子笼的内部空腔，作者在吡咯次级组分A的每个臂上引入一个额外的亚苯基，设计合成了新的亚组分A'，并组装得到了与Zn-5同构的Zn₃₀L₁₂分子笼Zn-6。该分子笼动力学半径仅增加到3.63 nm，而空腔体积大大增加，达到92,173 Å³（图4c）。该分子笼是迄今为止通过次级组分自组装策略构筑的最大结构，它由102个离散的有机次级组分和金属离子以精确定义的方式组合而成。它的形成证明了使用合理的设计原则可以打破笼组装的尺寸界限并可以突破笼封闭空腔的瓶颈。

图4. 笼空腔体积的比较和对其金属框架的几何分析。图片来源：Nat. Synth.

Ni(II)的离子半径相对较小，配位球的适应性较差，与柔性的联吡啶醛组分E组装只得到了Ni₅L₂的三明治结构Ni-7。作者使用MoloVol计算了金属核数N 从10到30的M_5nL_2n和M_5nL_3n系列分子笼的空腔体积，并在图4a中进行了对比。为了进一步研究导致这些不同结构形成的因素，作者对它们进行了几何分析。如图4d所示，作者计算了每个理想多面体的五边形面之间的二面角θ，发现随着核数N 的增加，对应的二面角也逐渐增大。具有三明治结构的Ni-7（n = 1）具有最小的二面角，θ = 0°，而配位顶点角度更开放的截端四面体Cu-3（n = 2）具有与正四面体相同的二面角70°。对于基于六配位金属离子的较大结构，随着金属核数从Co-4（n = 3）的N = 15增大到最大的截半二十面体（n = 6）的N = 30，θ逐渐增加到117°。

总结

通过改变不同因素调节金属中心的配位环境，如增加配体齿数、金属离子配位数及配体柔性，进而增大多面体中五边形在顶点的二面角 (θ)。基于这一新策略，作者系统地构筑了一系列核数 (N)、尺寸及空腔逐渐增大的M_5nL_2n系列分子笼。通过在配体上引入额外的亚苯基增长五胺组分，可以进一步扩大笼空腔，组装得到了世界上迄今为止具有最大良好封闭空腔的分子笼（直径为7.4 nm，空腔为92 nm³）。这些分子笼大的内部空腔有望通过疏水效应、电荷互补、氢键和静电相互作用，与生物分子，如疏水的膜蛋白或蛋白酶结合，在药物研发及生物大分子冷冻电镜结构解析领域展现出潜在的应用前景。

该工作一经发表就受到广泛关注，被剑桥大学新闻以“Super-sized nanocage could deliver bigger drug cargoes”为题进行了亮点报道 ^[2]。随后，全球科学新闻平台EurekAlert、美国科学网站Science Daily、phys.org、Verve times、The Medical News、Nanowerk、Azonano等多家科学新闻媒体予以转载 ^[3]。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Systematic construction of progressively larger capsules from a fivefold linking pyrrole-based subcomponent

Kai Wu, Tanya K. Ronson, Pingru Su, Zhi Chen, Leonard Goh, Andrew W. Heard, Xiaopeng Li, Fabian Klautzsch, Christoph A. Schalley, Mladen Vinković & Jonathan R. Nitschke*

Nat. Synth., 2023, DOI: 10.1038/s44160-023-00276-9

限时免费阅读全文：https://rdcu.be/c9kEM 

参考资料：

1. ISMSC Awards

https://www.chem.byu.edu/alumni/ismsc/awards/ 

2. Super-sized nanocage could deliver bigger drug cargoes 

https://www.ch.cam.ac.uk/news/super-sized-nanocage-could-deliver-bigger-drug-cargoes 

3. Article metrics

https://www.nature.com/articles/s44160-023-00276-9/metrics 

导师介绍

Prof. Jonathan R. Nitschke

https://www.nitschkegroup-cambridge.com 

https://www.x-mol.com/university/faculty/2580 

合作者介绍

Prof. Xiaopeng Li

www.ms-labs.cn/ 

Prof. Christoph A. Schalley

https://www.bcp.fu-berlin.de/en/chemie/chemie/forschung/OrgChem/schalley/index.html 

Astex Pharmaceuticals

https://astx.com/research-development/sustaining-innovation/ 

作者介绍

吴凯博士，2013年于兰州大学获得学士学位，导师王为教授，之后于中山大学苏成勇教授课题组获得博士学位，合作导师为潘梅教授。2018年起分别在多特蒙德工业大学Guido Clever教授课题组和剑桥大学Jonathan Nitschke教授课题组开展博士后研究。迄今共发表SCI论文32篇，以第一作者（含共一）发表论文8篇，代表性研究论文包括Nat. Synth.、Angew. Chem. Int. Ed.、Nat. Commun.、Natl. Sci. Rev. https://orcid.org/0000-0001-6336-7836 

本稿件作者：Alchemist