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ACS Cent. Sci. | 牛津大学Ben Davis团队: 手性保留的蛋白质翻译后编辑

英文原题:Stereoretentive Post-Translational Protein Editing

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通讯作者:Benjamin G. Davis

作者:Xia-Ping Fu (付夏平), Yizhi  Yuan (袁逸之), Ajay Jha, Nikita Levin, Andrew M. Giltrap, Jack Ren, Dimitrios Mamalis, Shabaz Mohammed, and Benjamin G. Davis*


背景介绍


蛋白质的翻译后化学编辑(chemical post-translational editing)策略能够直接对蛋白质的氨基酸侧链进行定点修饰,而无需在基因层面上进行干预。目前,该策略主要利用碳自由基物种与蛋白上的自由基受体——脱氢丙氨酸(Dha,dehydroalanine)间的自由基加成反应来引入蛋白质氨基酸侧链的化学修饰(图1a)。该反应条件温和、底物普适性广。然而由于需要制备Dha作为自由基受体,该方法会丢失目标氨基酸的α碳中心手性信息,最终生成具有D/L构型的差向异构体混合物。作者设想若能够在蛋白表面生成手性保留的L-丙氨酸自由基,那么该问题将得到解决。早在60年前就有研究表明半胱氨酸能够通过自由基脱硫机理生成丙氨酸自由基,该方法已被广泛应用于“无痕天然化学连接”(traceless native chemical ligation)反应制备多肽。但是该反应中需要加入还原性较强的三价膦物种(如TCEP)协同脱硫,无法兼容蛋白质中的二硫键,因此使用范围受限。我们通过计算发现C-S的自由基裂解可通过改变硫原子上取代基的电性来实现。这就意味着我们可以先对半胱氨酸进行修饰活化,随后引发脱硫反应成丙氨酸自由基,从而不再受到三价膦的限制。



文章亮点


全氟吡啶可以对蛋白质上的半胱氨酸残基进行选择性芳基化,得到四氟吡啶取代的半胱氨酸残基(Fpc,tetrafluoropyridyl-Cys)。Fpc在温和的光诱导条件下发生脱硫反应,从而在蛋白质表面生成手性保留的L-丙氨酸自由基,该自由基能被各种自由基受体捕获,实现目标氨基酸残基Cβ−Hγ, Cβ−Oγ, Cβ−Seγ, Cβ−Bγ, and Cβ−Cγ键的构建,从而灵活地对蛋白质侧链进行手性完全保留的选择性化学修饰(图1b)。该方法可以用来探索蛋白质侧链的多样性以及相关生物功能,同时也能用来合成有价值的生物偶联物,具有极大的应用潜力。


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图1. 在蛋白上构建Cβ−Xγ键的策略



图文解读


我们首先对水相中全氟吡啶与蛋白质的反应进行了研究。文献报道在有机相中(如DMF)全氟吡啶可以与巯基、氨基、羟基等官能团发生芳香亲核取代反应。但是我们发现在水相中,其仅能够与巯基反应,表现出良好的化学选择性。在弱碱性条件下全氟吡啶能够对组蛋白H3、H4,磷酸转移酶PstS,等一系列蛋白质的半胱氨酸残基进行选择性修饰,生成四氟吡啶取代半胱氨酸残基(Fpc)。


随后我们以PstS-Fpc178为模板底物对Cβ−Sγ键的断裂进行了尝试。我们发现Cβ−Sγ键能够被常见的光催化剂如 [Ir(dtbbpy)(ppy)2]PF6,Ru(bpy)3Cl2通过单电子转移过程(SET)还原,进而发生Cβ−Sγ键均裂生成L-丙氨酸自由基并最终生成PstS-Val178。更为有趣的是,Cβ−Sγ键能够与硫酚或二硼酸酯化合物(B2Cat2)形成电子给体-受体络合物(EDA complex),在光激发下发生电荷转移诱导Cβ−Sγ键均裂生成L-丙氨酸自由基并最终生成PstS-Val178。在利用B2Cat2为还原剂时我们不仅观察到PstS-Val178,而且还观察到硼化产物PstS-Bal178 (硼代丙氨酸残基,Bal)作为主产物。这意味着蛋白质上的Cβ−Sγ键断裂后生成的Cβ· 自由基能被B2Cat2捕获,生成Cβ−Bγ键。


在上述结果的激励下,我们尝试利用不同的自由基受体捕获生成的L-丙氨酸自由基(图2)。首先,我们以对甲基苯硫酚和稳态自由基TEMPO作为还原剂和自由基捕获剂时,能够顺利地构建Cβ−Oγ键;其次,我们以二硒醚类化合物为自由基受体时也能够顺利地捕获丙氨酸自由基生成Cβ−Seγ键,从而得到含硒蛋白。值得注意的是一些硫酚倾向于先与二硒醚类化合物反应,使得目标反应被淬灭。我们通过调控硫酚上的取代基以及位阻,能够有效的抑制这类副反应。最重要的是,当我们以烯烃为自由基受体,以弱亲核性硫酚如2-氯-6-氟苯硫酚以及 2,6-二氯苯硫酚为还原剂时,硫酚与烯烃的副反应(如迈克尔加成)能够得到有效的抑制,而烯烃与丙氨酸自由基的加成反应能够顺利进行,从而得到天然的氨基酸侧链以及其翻译后修饰的侧链。


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图2. L-丙氨酸自由基捕获策略的底物范围。


最后我们通过不同方法对修饰后的氨基酸残基的手性进行了鉴定。首先,我们利用本文方法合成了组蛋白H3−L-Bal9,将其与含三氟甲基的手性二醇试剂混合后进行19F NMR检测。在氟谱中我们仅观测到一个三氟甲基信号峰(图3a,蓝线),这表明体系中不存在非对映异构体,即仅存在L-构型硼代丙氨酸残基;其次,我们合成了PstS-Lys178,该位点能够被Trypsin识别并降解(L-lysine能被Trpsin识别而D-Lysine不能)(图3b);最后,我们合成了乙酰化的组蛋白H3−L-KAc18,其能够被组蛋白去乙酰化酶Sirt2识别并去乙酰化生成H3−L-K18 (H3−D-KAc18不能被Sirt2识别)(图3c)。综上,我们可以肯定修饰后的氨基酸残基的手性得到了完全保留。


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图3. L-手性保留的鉴定与表征。



总结与展望


我们发展了一种高效的光诱导脱硫策略,能够在蛋白质上生成自由基并且对其进行捕获实现蛋白质的翻译后化学编辑,从而实现蛋白质的“化学突变”(chemical mutagenesis,例如通过化学的方法将Cys转化为Ser,Lys等)。最重要的是,本方法可以保留氨基酸残基天然的L-构型,克服了过去通过Dha修饰策略无法得到单一立体构型产物的问题。目前该方法仍旧存在着许多局限,例如对于在构筑Cβ−Cγ键时存在效率低副反应多、反应机理不完全清楚等问题。



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ACS Cent. Sci. 2023, ASAP

Publication Date: February 24, 2023

https://doi.org/10.1021/acscentsci.2c00991 

Copyright © 2023 The Authors. Published by American Chemical Society

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