非血红素铁依赖酶催化的氮丙啶构建反应的机理探究

氮丙啶是一类含氮的三元杂环化合物。得益于其张力环的高化学反应性，含有氮丙啶骨架的天然产物具有良好的生物活性。遗憾的是，构建氮丙啶生物砌块的酶和生物合成策略仍然缺乏充分研究。近期，来自北卡罗莱纳州立大学的张玮成课题组基于计算机模拟筛选出了具有潜在构建氮丙环功能的酶。为了验证候选酶的活性，作者通过体外重构实验，结合瞬态动力学测量证明Fe(IV)=O物种通过催化碳氢键断裂进而引发氮丙啶环化反应。此外，作者使用底物类似物将反应途径从氮丙环化导向了羟基化，同时结合氧同位素示踪实验以及产物定量分析，系统性地阐释了极性胺捕获碳正离子进而构建氮丙啶砌块的反应机制。

图1. 在菲糖霉素和2-氨基异丁酸的生物合成中，两种不同的路径被运用于氮丙环的构建。

在自然界中，目前有两种不同的策略可以实现氮丙啶砌块的构建（图1）。在2-氨基异丁酸的生物合成中，氮丙啶是通过分子内氧化反应实现关环。为寻找其它的潜在候选氮丙环酶，作者利用序列相似性网络（Sequence Similarity Network, SSN）分析，以TqaL-pae为起点，筛选出了148个TqaL同源蛋白。随后，通过基因组邻域网络（Genome Neighborhood Network, GNN）对这些候选蛋白进一步分析，，预测出25个生物合成基因簇。值得一提的是这些基因簇还包括卤代烷酸脱卤酶（TqaF）和非血红素铁脱羧酶（TqaM）的同源蛋白（图2）。经过进一步的蛋白序列分析，作者从中选择了候选氮丙环酶TqaL-ha和TqaL-pd，并对它们开展了详细地研究。

图2. TqaL的序列相似性网络。其中已被报道的氮丙环酶用蓝色和黄色标出，而本篇文章中新鉴定的氮丙环酶用红色标出。

为验证其活性，作者在大肠杆菌中异源表达了TqaL-pd和TqaL-ha。GNN分析揭示 TqaL-pd应专一性识别L-缬氨酸（2），而TqaL-ha则可能可以催化L-缬氨酸（2）和L-异亮氨酸（3）的氮杂环丙烷合成。如图3a所示， TqaL-pd催化2以及TqaL-ha催化2和3均可通过LC-MS监测到4和5的生成。值得注意的是，在TqaL-ha与3的反应中未检测到6。这些结果不仅证实了TqaL-ha和TqaL-pd的氮丙环酶活性，并揭示TqaL-ha在氮杂环化反应中具有立体化学选择性。

图3. (a) TqaL-ha，TqaL-pd 催化 的L-缬氨酸（2）和 L-异亮氨酸（3）反应的液相色谱-质谱分析；(b) TqaL-ha 催化的以 L-2-氨基丁酸（9）为底物的反应的液相色谱-质谱分析。

众所周知，Fe/2OG酶通常使用Fe(IV)=O活化碳氢键引发反应。因此，作者推测类似的四价铁物种将通过对底物 2 的碳氢或氮氢活化来引发氮杂环化反应。底物2和它的C3-位氘代类似物（d₈-2）的停留吸收光谱（SF-Abs）（图4）及Mössbauer光谱实验证实Fe(IV)=O中间体攫取了2的C3氢原子以引发TqaL催化的氮杂环化反应。

图4. SF-Abs导出的瞬态动力学揭示了TqaL催化反应中使用Fe(IV)=O物种进行3位碳氢键裂解。

接下来，作者评估了一系列底物类似物的反应性。其中，TqaL-ha与9发生羟化反应生成的产物是L-苏氨酸（12）（图3b）。9引发的反应性变化为氮杂环丙烷形成的潜在反应机制提供了新的见解。如图5b所示，在2和3的3位碳氢键断裂后，形成的底物自由基向铁中心转移一个电子产生三级碳正离子，而后通过极性机理引发C-N键的形成。而底物9 被攫氢后新生成的次级碳正离子稳定性大大降低，羟基回弹可能成为主要途径，从而将反应重新导向到羟基化。同时，仔细检查TqaL-ha与2和3反应的液相色谱-质谱结果后，作者均发现了少量的羟化产物（~5%）。其中，在TqaL-ha催化3的反应中，两个三位羟基化产物（8和14）以约为三比一的比例生成。基于Fe/2OG酶催化的羟化反应机制，羟基回弹途径中碳自由基的立体化学应得以保留。因此，如果羟化反应是经历羟基回弹途径，那么3应该与9（9→12）的反应机制类似，仅能产生14。相反，如果经由碳正离子水合或内酯形成后的酯交换途径，羟化产物将产生多样性的立体化学。这和TqaL-ha与3反应生成非对映异构体8和14具有高度的一致性，并进一步暗示不同底物下形成的羟基化产物7、8、14和12可能来自不同的反应途径。

图5. 可能的氮丙环化机理，及在本文中运用到的机理探针结构。

为了进一步研究羟化反应途径作者进行了同位素示踪实验。当在¹⁸O₂或H₂¹⁸O中进行反应时，四种羟化产物具有不同的¹⁸O同位素标记比例。具体而言，12和14在¹⁸O₂和H₂¹⁸O中具有类似的¹⁸O标记水平，这表明它们的形成可能通过羟基回弹途径。另一方面，7和8在H₂¹⁸O中时可检测到大量¹⁸O标记，而在¹⁸O₂中时可检测的¹⁸O标记含量极低，这也更加吻合氮丙环的构建是经由阳离子或内酯淬灭途径的推测。

图6. (a) 在TqaL-ha催化的反应中，除了4和5（如图3所示）之外，还产生了羟化产物7、8和14。(b) 在H₂¹⁸O或¹⁸O₂存在下，羟基化产物7、8、12和14分别观察到不同水平的¹⁶O / ¹⁸O同位素标记（黑色/红色曲线）。

羟化产物的立体选择性以及同位素标记实验结果表明，底物的电性可能决定了反应的结果。而另一方面，由底物修饰引起的对底物在活性中心定位的扰动也应被考虑。为了区分这两种因素，作者制备并测试了底物2的氟代衍生物（15）。氟代替三个甲基氢原子后，空间位阻影响极小，但反应路径依旧被导向羟化。氟代衍生物的反应结果与羟基化产物的立体选择性及同位素标记实验结果在多个维度上有力地支持了碳正离子机理，并表明该中间体及其自由基前体的相对稳定性会影响反应结果。

结论

本文作者提出了一种基于计算机模拟分析来寻找未知酶候选物的策略，成功地将计算机虚拟筛选与瞬态动力学测量和产物结构解析相结合，提供了一种寻找具有特定功能的Fe/2OG酶的强力手段。同时作者还提供了大量直接有力的实验证据详细的阐释了TqaL-ha经由碳正离子中间体催化分子内碳氮键的形成的反应机制。Fe(IV)=O中间体裂解次级和三级碳氢键，形成C3自由基。在经过电子转移后，形成三级碳正离子的底物2 和3通过分子内碳氮键构建氮杂环丙烷砌块。相应地，次级碳正离子的稳定性降低，9经历羟基回弹路径并产生相应的羟化产物（图5b）。

近日，东京大学Abe课题组报道了TaqL-nc的立体选择性及底物特异性的相关研究。在和L-异亮氨酸（3）的反应中，与TaqL-ha仅产生5不同，TaqL-nc催化的反应会导致5和6的形成。因此，Abe课题组提出在TaqL-nc催化构建氮杂环丙烷基团的过程中C2-C3键可能会发生旋转。此外，突变体（I343A）能够调控立体化学选择性，进而影响产物的分布。这两篇文章中阐释的由两种相似Fe/2OG酶催化同一底物生成分子内碳氮键的立体化学选择性及立体发散性，为研究者提供了一个了解这些酶如何实现立体选择性控制的平台，同时也为其他潜在氮丙环酶的发现提供了新的思路。

这一成果近期发表在Journal of the American Chemical Society 上，北卡州立大学博士生茶理德为该论文的第一作者，Wei-chen Chang（张玮成）教授和卡内基梅隆大学Yisong Guo（郭以嵩）教授为该论文的通讯作者。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Mechanistic Studies of Aziridine Formation Catalyzed by Mononuclear Non-Heme Iron Enzymes

Lide Cha, Jared C. Paris, Brady Zanella, Martha Spletzer, Angela Yao, Yisong Guo*, and Wei-chen Chang*

J. Am. Chem. Soc., 2023, DOI: 10.1021/jacs.2c12664

导师介绍/ 招聘

Wei-chen Chang（张玮成）教授，北卡罗莱纳州立大学，课题组运用化学合成，生物化学反应测试、分子生物学，生物信息学等研究手段致力于（1）新颖金属酶的发现及反应化学机理探究，（2）开发有机分子化学酶法合成新路线以及非天然新反应。课题组自2016年成立以来在JACS，Angew. Chem. Int. Ed.，PNAS，Nat. Comm., ACS Catalysis等高水平期刊杂志发表文章十余篇。

课题组网站：

https://changlab.wordpress.ncsu.edu/ 

课题组长期招募博士研究生及博士后研究员，其中博士学位申请者应具有有机化学或生物化学等相关学科本科或硕士学位，并满足北卡州立大学的申请入学标准（https://chemistry.sciences.ncsu.edu/graduate/2538-2/），且具有有机合成或生物化学等相关领域的科研经历。而博后申请者具有有机合成或酶学，生物合成路径鉴定等与本课题组相关方向的研究背景，并发表过高水平的研究论文，拥有良好的英语交流与写作能力。有意者请讲个人简历和研究小结发送至张教授邮箱（wchang6@ncsu.edu），我们将尽快与申请人联系并安排面试。