“乾坤大挪移”：将被分析物整合形成报告分子——构建具有高灵敏度、排他选择性小分子荧光探针的有效途径

注：文末有研究团队简介及本文科研思路分析

高灵敏度、高选择性、大线性响应范围是理想小分子化学荧光探针所应具有的特性。但在化学荧光探针的设计和应用的实际过程中，常常遇到鱼与熊掌不可兼得的情况，对设计和合成具有更佳综合性能的荧光探针提出了挑战。比如将反应性荧光探针应用于检测生物样品中的小分子目标分子的检测时，由于生物样品中组成成分的复杂性，高灵敏度所要求的高化学反应性往往会降低探针的选择性。有时为了获得高选择性需要对灵敏度和线性范围作出妥协。这些挑战在应用荧光探针研究气体信号传导分子的生理和药理活性时显得尤为突出。气体信号传导分子是一类由生物体内源性产生并发挥生理调控功能的气体小分子。已确定的三种气体信号传导分子包括一氧化氮、硫化氢以及一氧化碳。

其中一氧化碳（CO）是一种众所周知的无色无味的有毒气体，在高浓度下可导致人缺氧甚至死亡。但研究发现一氧化碳也是一种可经由生理途径代谢产生的内源性气体信号传导分子。正常生理条件下，人体每天大约可产生10 ml 一氧化碳，其主要由血红素氧化酶（HO-1和HO-2）介导的血红素分解途径产生。研究发现内源性产生和外源性给予一氧化碳具有免疫调节、抑制炎症、调节生物钟、抗肿瘤转移等众多生理和药理活性，对由缺血再灌注、横纹肌溶解症、药物毒性导致的器官损伤具有预防和治疗作用。因此开发一氧化碳的递送系统也成为新药研发的热点之一。对开发气体分子治疗药物而言，测定一氧化碳在细胞、组织和血液中的浓度是极具挑战的关键环节，也是研究一氧化碳生理功能不可或缺的技术。对一氧化碳的传统检测和定量方法包括气相色谱法和荧光探针法。气相色谱法所需要特殊的分析仪器和专业知识对于生物研究而言可行性不佳，而荧光探针法则具有灵敏便捷和可用于细胞成像等优点。

已有文献报道的一氧化碳荧光探针，比如钯环配合物和烯丙基保护的荧光分子,对研究一氧化碳的生物活性起到了很大的帮助。然而其大多存在背景荧光信号干扰，选择性不足的缺点。究其原因是由于其检测化学机理均依靠利用一氧化碳的反应活移除荧光淬灭基团（如钯或烯丙酰基）从而恢复荧光基团本身的荧光活性。对于钯环配合物而言，由于钯配合物无法完全淬灭荧光基团的荧光，以及荧光淬灭基团可被生理条件下的其他反应活性分子，如硫醇、谷胱甘肽、酶解等条件所移除，背景荧光和对硫醇的交叉反应性往往无法避免。对于烯丙酰基淬灭的荧光分子而言，背景信号虽然较低，但移除该保护基所需的0价钯也可经由其他不依赖一氧化碳的还原反应所产生，从而引起兼容性和选择性问题。由于背景信号的强度与探针的浓度正相关，钯环配合物的荧光响应信噪比和线性范围均比较有限。这些局限导致已有的荧光探针只能用于定性或半定量分析或是荧光成像。更为关键的是选择性不足可导致可信度降低和对试验结果的误判。

为了解决以上问题，美国佐治亚州立大学王炳和（点击查看介绍）课题组开发了一种创新的一氧化碳荧光探针构建策略。该策略从一氧化碳可作为羰基化反应的合成砌块的反应原理出发，以钯环配合物构建无荧光的探针分子。在一氧化碳存在下通过羰基化引发的内酰胺化反应将一氧化碳以羰基的形式“转移”至新生成的荧光报告分子中。由于探针分子与荧光报告分子在化学结构和荧光性质上完全不同，无论是含钯的荧光探针还是移除钯后的探针分子在荧光报告分子的激发波长下完全不产生任何荧光信号。由于该羰基在生理条件下只可能由一氧化碳引入，而其他包括硫醇在内的任何条件即使将钯移除也不会产生任何荧光响应。由此该策略实现了对一氧化碳的排他选择性检测，极大的提高了检测结果的可靠性和可信度。同时由于其背景信号极低且不受探针浓度影响，其信噪比不受所使用探针的浓度限制，从而可真正实现在大浓度范围内（亚纳摩尔至数百毫摩尔）对一氧化碳的线性荧光响应和定量。该团队将这一策略应用于以两类荧光报告分子（邻苯二甲酰亚胺和萘二甲酰亚胺）为基础的荧光探针（CODP）的构建中，通过一系列结构改造和优化成功实现了对一氧化碳高灵敏度（CODP-106, 0.1 ppm 顶空气体；CODP-202, 2 nM 溶液），高反应速率（k₂= 220 M^-1·S^-1）的检测。选择性实验也证明，该类荧光探针对包括硫化氢、谷胱甘肽、过氧化氢等在内的生物相关反应活性分子均没有响应，而只对一氧化碳气体具有与浓度相关的特异性荧光响应。

该团队进一步根据所设计合成的一氧化碳荧光探针（CODP-102, CODP-106）的优异性质开发了一系列对包括体外培养细胞、小鼠血液和器官等生物样本中一氧化碳浓度进行半定量和绝对定量测定的分析方法。其中半定量方法可通过与阴性对照组实现，而绝对定量法可通过采用0-100 ppm的一氧化碳标准气体所制备的外标曲线法实现。其优点在于可使用细胞生物实验常用的荧光光谱仪或荧光酶标仪即可达到与气相色谱相当的灵敏度和定量分析能力。在对离体培养细胞的检测中发现，外源性给予一氧化碳气体、一氧化碳前药、以及给予血红素氧化酶（HO-1）诱导剂均可显著增加细胞内的一氧化碳浓度。在对小鼠血液和器官的分析显示小鼠口服给予本课题组开发的一氧化碳前药后血液中的碳氧血红蛋白（COHb）和肝肾组织中的一氧化碳浓度均显著升高。各结果与一氧化碳测定的金标准——气相色谱法相比没有显著性差异。在对COHb的测定中，通过对空白血液实施一氧化碳饱和处理和逐级稀释，可以利用荧光探针和荧光光谱仪或荧光酶标仪制备COHb的外标曲线从而实现了不依赖昂贵的碳氧血红蛋白计对未知血液样品的COHb进行测定。这些分析方法满足了一氧化碳研究领域中缺乏灵敏、可靠、经济的分析方法的实际需求。此外，该团队还发现由于萘二甲酰亚胺系列的荧光探针（CODP-202）具有更高的光稳定性和荧光量子产率，更适用于对培养细胞的荧光显微分析中。实验表明该荧光探针可通过荧光成像检测外源性给予一氧化碳气体或化学供体、以及内源性诱导HO-1表达导致的一氧化碳增加。

该策略使用被测试分子形成报告分子的一部分，从而实现了排他性的选择性并极大的提高了结果的可靠性，避免背景干扰和假阳性的发生，有望广泛应用于其他高灵敏度、高选择性的反应性小分子荧光探针的设计和构建中。

该成果近期发表在Journal of the American Chemical Society 上，文章的第一作者是佐治亚州立大学的博士后杨潇骁（共同通讯作者）、袁征南、吕雯。通讯作者是王炳和教授。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

De Novo Construction of Fluorophores via CO Insertion-Initiated Lactamization: A Chemical Strategy toward Highly Sensitive and Highly Selective Turn-On Fluorescent Probes for Carbon Monoxide

Xiaoxiao Yang*, Zhengnan Yuan, Wen Lu, Ce Yang, Minjia Wang, Ravi Tripathi, Zach Fultz, Chalet Tan, and Binghe Wang* 

J. Am. Chem. Soc., 2023, 145, 78-88, DOI: 10.1021/jacs.2c07504

通讯作者简介

杨潇骁博士，佐治亚州立大学化学系博士后、客座副教授。杨潇骁于2003年在北京大学医学部获得药学学士学位。2008年博士毕业于中国医学科学院、北京协和医科大学药物研究所，师从王德心教授。之后他留所继续从事科研工作，先后获得助理研究员、副研究员资格。2017年加入美国佐治亚州立大学化学系王炳和教授课题组从事博士后研究工作。研究领域是一氧化碳前药的设计合成以及生物活性评价，抗病毒、抗感染、以及抗肿瘤药物及其递送系统的设计与合成。在相关领域发表SCI论文50余篇，参与撰写一氧化碳药物研发英文书籍一本，申请发明专利3项。

王炳和博士，佐治亚州立大学化学系杰出终身校董事教授, 佐治亚科研联盟杰出学者及佐治亚癌症联盟的卓越学者，现任医药及诊断试剂研究中心主任。他曾担任化学系主任，文理学院副院长，代理院长。王炳和博士于1982年在北京医学院（现北京大学医学部）获得医药化学学士学位。1991年，他在美国堪萨斯大学药学院获得博士学位， 师从Matt Mertes教授和Kristin Bowman-James教授。之后他先后在亚利桑那大学Victor Hruby教授和堪萨斯大学Ronald T. Borchardt教授的实验室进行博士后研究。1994年，王炳和博士在俄克拉马大学药学院开始担任助理教授。他于1996年赴北卡罗莱纳州立大学化学系任教，并在2000年获得终身教职。他于2003年来到了现在所在的佐治亚州立大学化学系任讲席教授。他的研究方向包括药物设计和输送，分子识别，化学传感器和新诊断技术。他的工作在过去的27年不间断得得到国立卫生研究院的资助。王炳和博士发表了超过320篇文章，在全球被邀请演讲220多次。他曾任Medicinal Research Reviews总编辑20年。他也是Wiley药物研发系列丛书的创始编辑，至今已发表近30册。他参与编辑的书籍内容包括有药物设计，药物输送，医药分析，化学检测和糖类识别。在国际上，王炳和教授在多个协会及编辑部担任职务。他也组织及主持了几十个国际研讨会和学术会议。

https://www.x-mol.com/university/faculty/5237 

科研思路分析

Q：这项研究最初是什么目的？或者说想法是怎么产生的？

A：一氧化碳前药和递送系统开发是王炳和教授课题组的主要研究方向之一，并且已经获得了多类具有开发前景的候选物。在我们对一氧化碳和其前药开展作用机制、药物代谢和分布研究时发现已有的检测手段存在诸多不足，比如需要特定的气相色谱仪器、前处理繁琐；特别是已有报道的各种荧光探针均存在选择性不足和背景信号干扰的问题，使得我们对结果的可靠性不够确定。此外我们的合作课题组也希望我们能开发一种便捷、有效、可靠的一氧化碳检测手段以方便对生物样本中一氧化碳浓度的测定。我们通过对已有荧光探针产生非特异性选择性和背景荧光的化学机制性加以分析，提出是否可将一氧化碳通过化学反应形成荧光分子的结构的一部分，从而达到在没有一氧化碳的情况下完全不产生荧光并且达到对除一氧化碳以外的分子具有“排他性”的理想选择性。在概念验证过程中，我们选择了邻苯二甲酰亚胺类的ESIPT荧光基团，并通过形成钯环配合物与一氧化碳的羰基化反应和自发的内酰胺化反应形成荧光基团所需的化学结构。

Q：研究过程中遇到哪些挑战？

A：由于该荧光探针十分灵敏，甚至对空气中微量的一氧化碳（约0.5～2 ppm，由汽车尾气等燃烧化石燃料过程产生）都可产生反应，这给测定“空白”背景水平带来了一定困难。最后经过对所用溶剂进行彻底脱气处理以及选择实验当天适合城市空气污染物扩散消除的天气情况时进行测定基本解决了这一问题。此外如何不依赖额外的仪器对血液中的COHb定标以及定量决定了该探针是否在该项应用中具有取代碳氧血红蛋白计方法的重要因素。我们通过查阅文献以及通过对来自不同个体的小鼠血液进行一氧化碳饱和——氮气吹扫的方法确定了稳定的最高COHb含量从而进一步可通过逐级稀释的方法获得标准曲线解决了这一问题。