理性设计P450过加氧酶的隧道工程新策略

细胞色素P450单加氧酶是公认的多功能生物氧化催化剂，在生物化工、有机合成等领域有着巨大的应用潜力。大多数P450单加氧酶要通过复杂的氧化还原体系实现其催化功能，利用过氧化氢（H₂O₂）代替O₂将P450单加氧酶改造为过加氧酶，被认为是开发简单实用型P450生物催化剂的有效途径。但是绝大多数P450酶在H₂O₂存在下仅有极弱、甚至没有催化活性。近日，中国科学院青岛生物能源与过程研究所丛志奇研究员（点击查看介绍）开发出隧道工程理性设计P450过加氧酶的新策略，成功将两种NADH依赖型P450单加氧酶（CYP199A4和CYP153A_M.aq）改造为具有高催化活性的P450过加氧酶，并且成功应用到双功能小分子协同P450BM3过加氧酶体系。

丛志奇研究员团队近年来在国际上首次提出双功能小分子协同P450酶催化概念，成功将P450单加氧酶改造为能高效利用H₂O₂的P450过加氧酶（Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 7628. Very Important Paper），实现了对苯乙烯、小分子烷烃、乙苯等多种类型的高效氧化官能化。但是研究人员发现实现上述催化反应需要高出底物浓度数倍的H₂O₂才能实现高催化活性，这对更具实用性P450酶催化剂的开发提出了新的挑战。另外，研究人员将天然过氧化物酶与过加氧酶进行结构比对分析发现：天然过氧化物酶的血红素活性中心更多的暴露于蛋白表面，或者有较为开放的底物通道与蛋白表面相通，所以H₂O₂分子能够更容易到达活性中心。相反，烟酰胺辅因子NAD(P)H依赖型P450酶的活性中心大都深埋在蛋白内部，H₂O₂分子可能不容易通过疏水性底物通道进入活性中心，导致工程化P450过加氧酶在进行催化反应时通常需要高浓度的H₂O₂。鉴于P450酶结构中存在连接蛋白表面与活性中心的H₂O分子隧道（water tunnel），研究人员利用对P450酶的水隧道设计，促进H₂O₂进入其内部血红素活性中心，增强P450过加氧酶的催化活性（图1）。

图1. 过氧化氢隧道工程增强P450过加氧酶活性。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

研究人员利用Caver软件预测出NADH依赖的CYP199A4和CYP153A_M.aq酶血红素活性中心与溶剂环境之间的水隧道，通过计算分析鉴定出可能影响H₂O₂流入活性中心的隧道入口或瓶颈处的关键氨基酸，结合定点突变和多轮反应筛选，成功将CYP199A4和CYP153A_M.aq改造为工程化P450过加氧酶，工程酶的催化活性比野生型酶分别提高183倍和15倍。高分辨率晶体结构分析结果表明：水隧道瓶颈处的关键突变可能是H₂O₂更容易进入血红素活性中心的原因。此外，将水隧道工程同样应用到双功能小分子协同P450BM3过加氧酶体系，结果发现获得预期产物所需H₂O₂浓度被降低了95%以上，H₂O₂与产物的耦合效率达到95%。上述工作提出的H₂O₂隧道工程有望成为一个将P450单加氧酶改造为过加氧酶的普适性新策略，为新型P450过加氧酶生物催化剂的开发提供了新的思路和工具，有望进一步拓展P450在合成化学和合成生物学中的应用空间。

图2. 过氧化氢隧道工程增强P450CYP199A4和CYP153A_M.aq过加氧酶活性。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

这一成果近期发表在J. Am. Chem. Soc.上，中科院青岛生物能源与过程研究所博士生赵盼霞和孔繁慧以及姜谊平博士为论文共同第一作者。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Enabling Peroxygenase Activity in Cytochrome P450 Monooxygenases by Engineering Hydrogen Peroxide Tunnels

Panxia Zhao, Fanhui Kong, Yiping Jiang, Xiangquan Qin, Xiaoxia Tian, and Zhiqi Cong*

J. Am. Chem. Soc., 2023, DOI: 10.1021/jacs.3c00195

导师介绍

丛志奇

https://www.x-mol.com/university/faculty/69036