用于调控Aβ聚集的原位激活-化学激发的光动力治疗系统

阿尔兹海默症的光动力治疗在近年来成为研究的热点。Aβ蛋白的光氧化已成为一种有效的治疗阿尔茨海默病(AD)的策略。然而，激发光穿透颅骨和大脑的深度有限，这限制了它的进一步发展。近日，华南理工大学颜金武（点击查看介绍）团队和海南大学迟伟杰（点击查看介绍）团队提出了“原位激活-化学激发”的光动力治疗策略，以解决光源穿透组织难的问题。

在这项工作中，作者报道了一种原位触发和化学激发的光氧合系统，该系统能够在不需要外部激发源的情况下光氧化聚集的Aβ。作者设计并合成了一种2H-苯并咪唑衍生化的光敏剂BD-6-3，该光敏剂可介导Aβ聚集物在白光光照下被光氧化降解。为了可以实现“原位激活-化学激发”的策略，他们将BD-6-3和双[2,4,5-三氯-6-(戊氧基羰基)苯基]酯装载在介孔二氧化硅纳米颗粒中，再用乳铁蛋白修饰，形成原位激活-化学激发的光氧合体系Lf@6-3。AD病理微环境中高浓度H₂O₂可激活其产生化学发光。单线态氧 (¹O₂) 的产生可以光氧化Aβ聚集体，从而使其失活，抑制其神经毒性作用。

图1. 纳米颗粒Lf@6-3合成过程及通过H₂O₂原位激发-化学激发的策略光氧化Aβ以促进小胶质细胞吞噬的示意图。图片来源：Chem. Eng. J.

首先，设计合成了A-D-A型的光敏剂BD-6-3，激发波长为364 nm，发射波长为621 nm，有较长的Stork’s 位移，为257 nm。另外，BD-6-3只有在结合Aβ聚集体之后才出现明显的荧光增强，而且在PBS中结合Aβ聚集体后的荧光量子产率由8.7%增加到了28%。在APP/PS1小鼠的脑切片成像中显示，BD-6-3可以很好的染色Aβ斑块。

图2. 新型光敏剂BD-6-3的设计与评价。(a)合成BD-6-3路线。(b) BD-6-3(1µM)在PBS中的紫外/可见吸收和发射光谱。(c) PBS中含有或不含Aβ1-42聚集物(10µM)的BD-6-3(1µM)的紫外/可见吸收光谱。(d)含或不含Aβ1-42聚集物、低聚物和单体的PBS中BD-6-3(1µM)的荧光光谱。(e) BD-6-3与Aβ1-42聚集物的结合常数(K_d)测量。(f)用各种生物相关物种(10µM)处理后，BD-6-3(1 µM)在PBS中的荧光强度。(g)Thio-S与BD-6-3共定位分析。(h) APP/PS1转基因AD小鼠脑切片组织学染色(13个月)。图片来源：Chem. Eng. J.

¹O₂是光氧化Aβ的关键因子。进一步地，作者评价了光敏剂BD-6-3产生单线态氧的能力，发现其单线态氧的产生效率与阳性对照化合物相当。通过理论计算的ΔEst与SOC也和实验结果基本一致，有较小的能隙（0.69 eV），SOC值为0.34。令人惊喜的是，当BD-6-3与Aβ结合后，单线态氧的效率进一步提高。在用ThT监测光照和暗黑条件下，BD-6-3孵育的Aβ的聚集程度时发现，在光照组，Aβ的聚集程度随着时间延长而减弱，说明在BD-6-3加光照的组，促进了淀粉样蛋白的解聚。因此，BD-6-3可能是一个“关-开”型的用于光氧化Aβ的光敏剂。

图3. (a) BD-6-3和RB在378 nm处ABDA的UV/Vis变化。(b) BD-6-3作用下ABDA在6 min内的荧光变化。(c) ωB97X-D/Def2svp水平下单重态和三重态之间的能量差(ΔEST)和自旋轨道耦合(SOC)值，以及S1和T3的主要转变轨道分布。(d)加入Aβ与BD-6-3共孵育，ThT荧光随照射时间的变化。(e) BD-6-3 (200 μM)/参比RB和糠醇(Fur A, 2 mM)混合物在287nm处的吸收变化。含/不含Aβ聚集物(20 μM)， 37°C随光照射时间的变化。所有测试均在PBS进行。图片来源：Chem. Eng. J.

受到以上结果的鼓励，作者对光氧化Aβ这个过程进行了更为深入的评价。在圆二色光谱实验结果中显示，单独的Aβ无论是在光照或黑暗组，都保持有完整的β片段，在加入BD-6-3和光照后，β折叠的特征峰几乎消失，说明BD-6-3+光照组的蛋白二级结构发生 明显的变化，β结构被破坏。同样地，用同样的条件处理蛋白样品，用透射电镜观察不同组别的蛋白形态的变化。从TEM照片可看出，正常状态下的Aβ蛋白呈现纤维状，与BD-6-3共同孵育的Aβ蛋白，在加入光照后，观察不到纤维状，只有点状的Aβ单体，说明Aβ纤维在BD-6-3和光照的作用下解聚成了单体。关于BD-6-3光氧化Aβ后是否可以降低Aβ带来的神经毒性，他们也进行了研究，发现，与BD-6-3共同孵育光照后的Aβ蛋白组，神经细胞活力明显高于Aβ本身带来的神经细胞毒性，这说明，被光氧化后的Aβ蛋白神经毒性是低于天然的Aβ蛋白的。 

图4. 通过(a) CD光谱和(c) TEM分析光诱导抑制Aβ聚集物。比例尺= 200 nm。(b) BD-6-3诱导Aβ聚集物光氧化对PC12细胞活力的影响(BD-6-3, 5 μM, Aβ ,20 μM，光照时间1 h，孵育24 h, n = 6，均值±标准差，t-test, *P < 0.1，**P < 0.01，***P < 0.001)。(d)在黑暗和光照条件下，BD-6-3处理后BV2细胞对FAM-Aβ的细胞摄取。图片来源：Chem. Eng. J.

为了实现原位激活-化学激发的目标，他们将光敏剂BD-6-3和CPPO装载到修饰有乳铁蛋白的介孔二氧化硅里，形成纳米颗粒Lf@6-3。CPPO可以利用AD病灶微环境中过量的H₂O₂激活形成高能中间体，通过化学能量共振转移的方式传递到BD-6-3,以激发产生化学发光。介孔硅修饰的乳铁蛋白主要是为了Lf@6-3更好穿透血脑屏障。同样地，对Lf@6-3化学发光、单线态氧产生能力、释药速率以及介导的光氧化Aβ以降低神经毒性进行了评价，发现有比较好的效果。

图5. (a)说明BD-6-3在H₂O₂存在下化学发光和产生¹O₂的原理。(b)有/无Aβ的Lf@6-3在1 h内的化学发光强度。(c)有H₂O₂ (50 μM)存在Lf@6-3时ABDA的时间依赖性荧光光谱。(d)监测BD-6-3用量对Lf@6-3的释放曲线。(e) Aβ+Lf@6-3光加氧对细胞活力的影响(A =对照，B = H₂O₂, C = Aβ+ Lf@6-3 + H₂O₂, D = Aβ+ Lf@6-3, E = Aβ, F= Aβ+ Lf@MSN + H₂O₂, G = Lf@6-3) 。图片来源：Chem. Eng. J.

图6. Lf@6-3对BV2细胞摄取和降解Aβ的影响。(A)用Lf@6-3和FAM-Aβ孵卵后BV2细胞在黑暗/光照条件下(含//不含H₂O₂)的CLSM图像。对于DAPI，λex = 405 nm，λem = 425 -470 nm; FAM-Aβ, λex = 488 nm, λem = 508-530 nm。比例尺= 20 μm。(B) Aβ摄取后荧光强度的变化。图片来源：Chem. Eng. J.

在研究BV2细胞对的Aβ摄取行为时发现，只有Lf@6-3+光照组或Lf@6-3+H₂O₂组才出现Aβ明显被BA2吞噬的行为，说明只有被光敏剂产生的¹O₂氧化的Aβ才能促进小胶质细胞对其吞噬。

小结

作者报道了原位激活-化学激发的策略用于光氧化Aβ聚集体，借助AD病灶微环境过量的H₂O₂实现化学能转化为光能，产生单线态氧实现光氧化Aβ，从而降低异常聚集的Aβ带来的神经毒性，为治疗AD或其他淀粉样疾病提供一个新的思路。

这一成果最近发表在Chemical Engineering Journal 上，文章的第一作者为华南理工大学硕士研究生杨金荣，通讯作者华南理工大学颜金武副教授和海南大学迟伟杰教授。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

An in situ-triggered and chemi-excited photooxygenation system for Aβ aggregates 

Jinrong Yang, Weijie Chi, Wen-Jing Shi, Lei Zhang, Jin-Wu Yan

Chem. Eng. J., 2023, 456, 140998, DOI: 10.1016/j.cej.2022.140998

导师介绍

颜金武

https://www.x-mol.com/university/faculty/76186

迟伟杰

https://www.x-mol.com/groups/weijie_chi