金坚团队JMC：首例靶向LDH的PROTAC分子

乳酸脱氢酶（LDH）是一种关键的糖酵解酶和侵袭性癌症的生物标志物。LDHA 和 LDHB 是LDH的两个主要亚基，可以催化糖酵解中乳酸和丙酮酸的相互转化，与经典的“Warburg 效应”相关联。LDHA 和 LDHB的表达水平在多种癌症类型如胃癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌和胰腺癌中明显升高，而且LDHA 和 LDHB 水平升高与癌症患者的不良预后有关。因此，LDH已被公认为有前途的抗癌药物靶点。制药公司和学术单位已经开发出许多有效的LDHA/B抑制剂，但是这些抑制剂因为各种原因（PK性质不佳、动物体内实验效果不好等）没有推入临床，目前开发针对LDH治疗癌症的替代治疗策略的需求仍未得到满足。

蛋白质水解靶向嵌合体（PROTAC）技术如今正在如火如荼的研发进展中，受到药物研发领域的极大关注。西奈山伊坎医学院金坚教授（Dr. Jian Jin）课题组长期致力于开发新型PROTAC技术及其类似工具。近日，金坚教授团队在Journal of Medicinal Chemistry 杂志上发表研究论文，利用前人报道的LDHA/B抑制剂，将其改造并通过合适的链与E3连接酶的配体连接，从而得到了实现首例降解LDH的PROTAC分子MS6105。

图1. LDH抑制剂的共晶结构分析及前体设计

化合物5和6（NCATS-SM1441）是近期报道的活性较好的LDHA/B抑制剂。6与LDH的共晶显示，羧酸取代的噻唑环伸向结合口袋内部；磺酰胺基团也可以与相邻的氨基酸形成氢键相互作用；末端的炔基噻吩则延伸至溶剂可及区域。基于共晶结构和之前报道的SAR研究，作者设计了合成前体化合物8，选择了VHL作为E3泛素连接酶，进而合成了一系列不同链长的PROTAC分子，如图2所示。

图2. 基于LDH-VHL 的一系列PROTAC分子结构

接下来作者对这些分子在胰腺癌细胞系PANC1中降解LDHA的能力进行了考察，其结果如图3所示。在两个浓度的测试下，长碳链的化合物和PEG1连接的化合物表现出较好的降解效果，而LDH抑制剂5本身并不能降解LDHA蛋白。经过初步筛选之后，作者将活性较好的几个化合物进一步降低了浓度，化合物22 （MS6105）展现出了最好的LDHA降解能力。因此，选取化合物22作为接下来研究的重点。

图3. 对化合物13-32降解LDHA能力进行研究

图4. 对化合物19-22, 24降解LDHA能力进一步的研究

随后在PANC1细胞系中对化合物22进行了更加详细的表征，如图5所示。化合物22除了可以剂量依赖的降解LDHA，也同样可以降解LDHB，24 h时即可以观察到明显的降解, 48 h达到最大降解。LDHA: DC₅₀ = 38 ± 0.5 nM, D_max = 93 ± 2.6%; LDHB: DC₅₀ = 38 ± 0.5 nM, D_max = 93 ± 2.6%。

图5. 对化合物22 （MS6105）的进一步研究

为了更好的对化合物22进行研究，作者还合成了两个阴性对照化合物，结构如图6所示。在化合物22的VHL连接酶配体的关键基团羟基处引入苄基，得到了化合物33；将化合物22与LDH结合的关键基团羧酸基改为二甲酰胺基，得到了化合物34。与化合物22对比，这两个阴性对照的化合物均不能降解靶蛋白LDHA，对降解机制有了一定的验证。随后作者又对降解机制进行了进一步的研究。作者发现VHL小分子配体、MG132 (蛋白酶体抑制剂)、MLN4924 (Nedd8激活酶的小分子抑制剂) 及LDH抑制剂化合物5都可以明显抑制化合物22对LDHA蛋白的降解。这一结果表明，化合物22介导的LDHA/B的降解依赖LDH、VHL和泛素-蛋白酶体降解系统。

图6. 对化合物22 （MS6105）的降解机制研究

为了进一步研究化合物22降解LDH可能带来的其他影响，作者随后进行了蛋白质组学的研究。如图7所示，可以看出降解剂 22 除了显著降低了 LDHA和LDHB的蛋白水平之外，与 DMSO 和化合物 33相比，该化合物还可以导致52 种蛋白的上调和下调，其中39种蛋白都是参与细胞代谢过程的蛋白。这些结果表明，化合物 22 对 LDHA 和 LDHB 具有相对选择性，进而对细胞代谢过程具有相对选择性。

图7. 对化合物22 （MS6105）的蛋白质组学的研究

接下来如图8所示，作者考察了化合物22、33、34和5在其他胰腺癌细胞系中的效果。细胞增殖实验的结果显示，相比于化合物33、34、5，化合物22表现出对3种不同的胰腺癌细胞一定的抑制细胞增殖的活性，包括准间质状态和上皮状态胰腺癌细胞系。Western Blot结果表明，化合物5对细胞中的LDHA水平没有影响，而化合物22表现了较好的降解LDHA的能力。

图8. 对化合物22 （MS6105）的在其他胰腺癌细胞系中的活性考察

最后作者对化合物22的药代动力学PK性质进行了评估。以相对较低的剂量5 mg/kg进行单次IP注射可在血浆中24小时内产生良好的暴露水平（图9）。在8小时观察到峰值血浆浓度（1800 nM）。此外，化合物22的给药小鼠耐受性良好。综上所述，这些结果表明化合物22可能是研究体内LDH降解影响的有价值的化学工具。

图9. 对化合物22 （MS6105）的PK研究

综上所述，通过探索各种接头长度和组成的 SAR 研究，作者报道了首例靶向LDH的PROTAC分子MS6105。该分子可以较好的降低细胞中的LDHA和LDHB水平，与LDH 抑制剂相比，更有效地抑制多种胰腺癌细胞系的增殖。此外，该化合物在小鼠 PK 研究中通过 IP 注射具有可观的生物利用度，适用于体内药效研究。总的来说，化合物 22 可以成为评估靶向 LDHA 和 LDHB 在胰腺癌和其他 LDH 依赖性癌症中的有治疗潜力的有用化学工具。这份工作近期发表于Journal of Medicinal Chemistry 上，共同第一作者为孙宁博士和Md Kabir (博士在读)。

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Discovery of the First Lactate Dehydrogenase Proteolysis Targeting Chimera Degrader for the Treatment of Pancreatic Cancer

Ning Sun, Md Kabir, Youngeun Lee, Ling Xie, Xiaoping Hu, Julia Velez, Xian Chen, H. Ümit Kaniskan*, and Jian Jin*

J. Med. Chem., 2022, DOI: 10.1021/acs.jmedchem.2c01505