从0到99% ee——神奇的手性结晶技术

分子的立体化学是许多领域的重要研究主题，随着药理学、生物学、毒理学和化学等领域的不断发展，人类对手性纯化合物的需求也在日益增加。2021年，一项关于美国食品和药物管理局（FDA）批准的药物调查结果显示，从2015年到2020年被批准的药物中有63%是手性的。目前，获得单一对映异构体有四种基本方法，即，手性分离、不对称合成、生物生产或干预（通过生物体或来自生物体的酶）、手性结晶。而在工业规模上，手性纯化的主要方法是手性分离、不对称酶解和手性结晶。作为一种非常重要的手性纯化方法，手性结晶技术的主要优点是可从外消旋体混合物中得到>99% ee值的对映异构体，从而避免了对映体浪费。

近日，美国德克萨斯大学阿灵顿分校的Daniel W. Armstrong教授课题组在Chirality 上发表综述文章对手性结晶技术进行了总结：主要分为去消旋化（deracemization）和共结晶（cocrystallization），前者具体又分为磨损增强的去消旋化（attrition-enhanced deracemization）和温度循环诱导的去消旋化（temperature cycling-induced deracemization）；而后者分为包合配合物共结晶（inclusion complex cocrystallization）和无机离子共结晶（inorganic ionic cocrystallization）。本文也将从这几个方面来介绍神奇的手性结晶技术。

首先，简单介绍几个概念。众所周知，结晶是化合物相变形成高度有序晶体的过程，过饱和溶液在特定溶剂和温度下就会结晶。从溶液中形成最小的稳定晶体称为晶核，在溶液中形成晶核的过程叫做成核现象，一般分为均相成核和异相成核。通常情况下，为了获得更高纯度的晶体，重点是要确保较低的成核速率，以获得较大的晶体。当外消旋混合物结晶时，可以形成三种类型的固体：聚集体（conglomerates）、外消旋化合物（racemic compounds）和假外消旋体（pseudoracemates）。聚集体是一种晶体的混合物，其中每个单独的晶体由单个对映异构体组成；在外消旋化合物中，两种对映异构体在同一晶胞中平等共存；假外消旋体是指形成无重复结构的固溶体。

1. 去消旋化

去消旋化是一种特殊的结晶过程，可以使外消旋混合物的其中一个对映体大量富集。但是，该化合物必须满足以下条件：（1）它必须能在溶液中形成聚集体；（2）它必须能在溶液中外消旋化；（3）成核速率必须低于晶体生长速率。这个过程往往需要加入单一对映异构体的晶体作为晶种以防止随机成核，随着“单一对映体”晶体不断生长，溶液中的化合物也在不断外消旋化。如果控制晶体生长速率，使外消旋化速率高于晶体生长速率，就可以顺利完成去消旋化结晶过程。然而，如果溶液中的对映异构体不能外消旋化，那么首先结晶出来的对映异构体将最终达到不再过饱和的溶液浓度。如果通过冷却或其它方法让溶液进一步结晶，那么相反构型的对映异构体将从溶液中结晶出来，此时就会形成对映体晶体的混合物。1941年，Havinga通过仔细控制温度以减缓成核过程实现了去消旋化（Chemisch Weekblad, 1941, 38, 642-644），同时用单一对映体的晶体作为晶种来限制相反对映体结晶。随后，Kondepudi 等人研究了手性对称性破缺结晶（Science, 1990, 250, 975-976），如果溶液的成核速率较低，剧烈搅拌溶液并使其结晶，那么在不添加单一对映体晶种的情况下就能增强去消旋化，此时所得晶体的手性是随机的。

1.1 磨损增强的去消旋化

磨损是将溶液中产生的晶体研磨成更小晶体的过程。2004年，Viedma对Kondepudi制备光学纯氯酸钠晶体的实验进行改进后，报道了磨损增强的去消旋化（J. Cryst. Growth., 2004, 261, 118-121），后者又称为Kondepudi-Havinga熟化或Viedma熟化。具体而言，Viedma使用更饱和的NaClO₃溶液，使得晶体成核速率更高。将该溶液连续搅拌48 h后，产生的NaClO₃晶体光学纯度为~99%。需要指出的是，影响磨损增强去消旋化的主要因素有以下三方面：（1）Ostwald熟化；（2）在溶液中可外消旋化；（3）磨损（研磨）。如图1所示，这种晶体富集被认为是由磨损（研磨）造成的，这促进了固相和溶液之间的平衡。这种平衡促进了不占优势的手性晶体再溶解，如果时间充足，就可以在最终结晶产物中实现大量单一异构体的富集，并且这种独特的方法已被证明适用于许多手性化合物的纯化，包括抗凝血药物氯吡格雷（Plavix）。以手性黄酮类化合物为例，它们可以在溶液中通过开环和关环实现外消旋化（图2）。2020年，Masami Sakamoto等人在体系中加入玻璃微珠进行搅拌并分别对碱、溶剂、温度和搅拌时间进行了细致的考察，最终以高达99% ee值的对映选择性得到相应的手性黄酮衍生物（Cryst. Growth Des., 2020, 20, 5676-5681）。

图1. 去消旋化原理示意图，S和R代表两个对映体的绝对构型。图片来源：Chirality

图2. 手性黄酮的去消旋化。图片来源：Cryst. Growth Des.

1.2 温度循环诱导的去消旋化

与磨损增强的去消旋化不同，温度循环诱导的去消旋化是利用温度循环——在温度急剧上升之后缓慢冷却——以诱导晶体生长而不引发成核。从理论上来讲，这两种方法结晶的机理非常类似，因为它需要以下条件：依赖于晶体大小的溶解度、对映体特异性聚集以及在溶液中可外消旋化，在此温度起关键作用。较小的晶体在溶液中更容易溶解，因此当溶液经过加热循环时，最小的晶体会溶解，只留下较大的晶体。这意味着其中形成的更大、数量更多晶体的对映体都不会完全重新溶解，因此析出晶体的对映选择性会随着每个温度循环而逐渐增加。显然，温度循环诱导的去消旋化的关键之处在于精确的温度控制。加热和冷却的速率和所有选择的温度对去消旋化的速率以及达到完全去消旋化所需的时间有显著影响。

2018年，Marco Mazzotti等人使用异丙醇和乙腈为溶剂、DBU为消旋化试剂，对温度循环诱导的N-(2-甲基苯亚甲基)苯甘氨酸酰胺（NMPA）的去消旋化进行了研究（Cryst. Growth Des., 2018, 18, 1873-1881），他们发现如果冷却速度较慢，那么达到>99% ee值所需的循环次数就会减少。然而，完成去消旋化过程所需的时间并没有减少。当冷却速率为0.14 °C/min，需要在6次循环后达到>99% ee，一共需要12小时。当冷却速率为1.3 °C/min，需要接近11次循环才能达到相同的对映选择性；然而，该过程的总时间大约为8小时。

图3. 温度循环诱导NMPA去消旋化。图片来源：Cryst. Growth Des.

2. 共结晶

共结晶最初是在20世纪60年代的聚合物研究中发现的。当两种不同的化合物形成重复的晶体结构时，可称为共结晶，这最初被认为是提纯聚合物的方式，其目标是获得一个狭窄分子量分布的聚合物。后来发现手性化合物也可以与其它手性化合物形成共晶，使得该方法成为纯化外消旋物的潜在手段。如图4所示，大多数共晶来自于手性分析物与其它手性化合物形成的晶体，随着共晶对的形成，它们可以被视为非共价的非对映体单元，类似于非对映体盐。通常情况下，对映选择性共结晶是通过使用结构相似的手性化合物来实现的，使它们形成共晶体，这也意味着必须进行广泛筛选以找到具有手性识别的化合物来形成共晶。然而，Spinguel等人筛选了125种可能的手性化合物组合，仅发现四对化合物产生对映选择性共晶体，其中两对已在文献中报道。例如：抗癫痫药物左乙拉西坦（levetiracetam）是乙拉西坦（etiracetam）的一种对映体，它能够与抗炎镇痛药布洛芬的(S)-对映体形成共晶，但是(R)-布洛芬与左乙拉西坦之间却不会形成共晶（Cryst. Growth. des., 2018, 18, 3654-3660）。这种方法是分离(S)-布洛芬和左乙拉西坦作为共晶的理想方法，而且(R)-布洛芬也可以从母液中提取出来。

图4. 手性共结晶原理示意图。图片来源：Chirality

2.1 包合配合物共结晶

通过包合物与手性主体共结晶是一种有趣的共结晶形式。许多手性选择剂（如：环糊精及其衍生物）可以形成包合物以促进对映体的分离。这种主客体现象已被应用于各种分离技术，例如：毛细管电泳（CE）、高效液相色谱（HPLC）和气相色谱（GC）。1987年，Toda观察到手性生物碱与非手性化合物表现出包合行为，这也是该方法的第一个实例。理论上，该策略也可以推广到手性化合物上。Toda随后合成了特定的生物碱以改善手性识别，并能够形成>99% ee值的共晶。

2.2 无机离子共结晶

无机离子共结晶是一种新技术，它利用无机盐与手性化合物结晶来改变晶体类型，从而实现对映体的分离或富集。这样做的目的通常是在离子络合物形成后可以形成聚集体共晶。该技术实用性较强，因为它不需要使用任何手性添加剂来实现分离。需要指出的是，无机离子共结晶要求所研究的手性化合物必须能够作为配体与各种金属离子相互作用。

手性氨基酸的重要性众所周知，所有氨基酸也可以与各种金属形成络合物，这使得它们成为手性无机离子共结晶应用的主要底物。例如：卤化锂能够与组氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸等氨基酸形成聚集体晶体，从而有利于进一步的手性分离。如图5所示，当前文提到的药物乙拉西坦与氯化锌按1：1的比例混合时，乙拉西坦能够与氯化锌形成聚集体。如果比例超过此值，那么晶体就会形成外消旋化合物。

图5. 乙拉西坦与ZnCl₂的离子共结晶。 图片来源：Chirality

去消旋化和共结晶这两种手性结晶技术的简单总结见下表：

总之，通过手性结晶分离对映体的各种先进技术（即去消旋化和共结晶）已经发展起来。由于不产生对映体废物，去消旋化可能是生产对映体纯产品的最经济的选择，该方法主要要求化合物必须以聚集体形式结晶，并能够在溶液中外消旋化，这也限制了适用化合物的范围。此外，使用共结晶可以通过形成包合物或形成聚集体晶体来纯化更大的对映异构体库。通过无机离子结晶与共结晶不同，所使用的金属盐不是手性的，所以在溶液中不需要考虑去消旋化。共结晶在技术上对大量的手性化合物是可行的，但需要进行广泛筛选以找到合适的化合物进行配对，未来仍需要进一步的研究来更好地预测哪些化合物形成共晶体，从而避免大量的实验筛选。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Recent advances in the field of chiral crystallization

Joshua I. Putman, Daniel W. Armstrong

Chirality, 2022, 34, 1338-1354, DOI: 10.1002/chir.23492