酶内电场对酶催化循环的调控机制

酶作为一类具有催化功能的蛋白质，是生命体中执行各种生物代谢和生物合成的主要催化剂。在酶催化过程中，酶环境的协同作用对酶催化活性和选择性的调控发挥着至关重要的作用。在酶环境中，除了其所包含的氢键、范德华等近程非键相互作用，酶环境的长程静电作用能够极大地稳定反应过渡态的电荷分布或偶极矩，从而有效降低催化反应的活化能并加速酶催化反应。前期绝大多数研究认为酶的长程静电作用，即酶的内电场（IEF），能够有效促进酶对底物的修饰过程。然而，目前尚未能明晰内电场是如何合理地调节酶的催化循环过程中不同的反应步骤，是促进酶的催化反应的所有步骤，还是会选择性地促进或者抑制催化循环中的不同反应步骤？为了充分探讨这个问题，厦门大学王斌举教授（点击查看介绍）团队采用多尺度理论模拟方法，对酪氨酸羟化酶（TyrH）开展了相应研究。研究发现，内电场很大程度上抑制了第二阶段底物修饰步。相反，内电场有效的促进了第一阶段H₂O₂转化成活性物种Cpd I的反应，这一结果说明自然界所进化的酶内电场倾向于促进催化循环中能垒较高的反应步骤，而非所有反应步骤。该研究将对深入认识酶的催化功能具有重要的意义。

图1. TyrH的IEF选择性促进活性物种Cpd I的生成步骤，抑制底物L-Tyr的氧化步骤。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

首先，团队采用分子力学-量子力学（QM/MM）组合方法，对TyrH的催化机理开展了系统研究。对于第一阶段H₂O₂的活化反应，研究表明Heme的羧基作为碱，可有效介导H₂O₂的异裂反应，计算的能垒为17.2 kcal/mol （见图2）。对于第二阶段底物L-Tyr的氧化，反应首先通过His88介导的质子耦合电子转移反应（PCET）生成底物自由基，进而底物自由基可以极大促进氧原子从CpdII到底物的转移过程。该步骤的能垒为21.9 kcal/mol，也是整个催化循环的决速步（见图3）。

图2. TyrH通过异裂机理活化H₂O₂生成Cpd I (单位：kcal/mol)。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

图3. Cpd I 对底物L-Tyr的催化氧化机理 (单位：kcal/mol)。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

如图4a所示，酶环境激发的电场方向接近O-O轴线与Fe-O轴线的角平分线方向，总电场强度为44.32 MV/cm。其中，电场在O-O轴上的分量方向为从远端O2指向近端O1，分量大小为27.43 MV/cm。计算表明，在没有酶环境作用的非酶反应模型中，O-O断裂需要高达25.5 kcal/mol的能垒。如果在非酶模型中沿着O-O方向添加定向外电场，以模拟O-O方向的内电场作用，可发现从O2到 O1方向的外电场能够有效降低O-O断裂能垒（图4b），这表明内电场能够有效促进O-O键断裂，从而生成Cpd I。为了进一步证实该结论，团队在QM/MM计算中施加了和内电场相反的外电场，以抵消酶环境的内电场效应。计算表明，随着内电场被外加电场不断抵消，O-O断裂的能垒不断升高。当O-O方向上约20 MV/cm的内电场被抵消时，O-O异裂能垒升高了超过5 kcal/mol（图4c），进一步佐证了O-O方向内电场对Cpd I生成反应的促进作用。

图4. IEF对O-O异裂和Cpd I生成的影响。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

在TyrH酶中，Cpd I的Fe-O方向上的内电场分量为36.97 MV/cm，且方向为从O指向Fe。在酶环境中，Cpd I介导的PCET反应吸热8.6 kcal/mol，而非酶模型中（无内电场影响下），同样的PCET反应放热8.1 kcal/mol，说明TyrH的内电场倾向于抑制PCET反应。为了验证这一猜想，在QM/MM计算中施加了外加电场以抵消酶的内电场，发现PCET反应吸热逐渐减少，而当15MV/cm的内电场完全被抵消时，反应变为放热过程（图5b）。这表明，酶内电场对第二阶段的反应，即Cpd I介导的底物氧化反应，产生了抑制作用。

图5. IEF对底物L-Tyr羟基化的影响。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

研究人员对比了酶环境中的反应势能面与剔除内电场影响的非酶反应势能面，发现对于不包含酶环境影响的非酶反应，O-O断裂过程十分困难，需要25 kcal/mol的能垒（见图6a）。因此，作者明确酶内电场显著的降低了原本难以发生的O-O裂解的反应能垒，与非酶反应相比，内电场使得整体反应快了超过400倍。

图6. IEF选择性优化加速Cpd I形成步骤，而非底物L-Tyr羟基化步骤。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

综上，作者发现酶环境中的IEF并不一定会促进产物的生成反应，但其会选择性地促进催化循环中的一个或多个较为困难的步骤。该研究拓展了我们对大自然如何利用天然的内电场作为 "智能试剂" 来调节酶催化反应性的理解。因此，在多个研究领域如药物设计、生物合成以及生物催化等都将具有重要意义。

这一成果近期发表在J. Am. Chem. Soc.上，文章的第一作者是厦门大学博士研究生彭炜和严升恒。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

How Do Preorganized Electric Fields Function in Catalytic Cycles? The Case of the Enzyme Tyrosine Hydroxylase

Wei Peng, Shengheng Yan, Xuan Zhang, Langxing Liao, Jinyan Zhang, Sason Shaik,* and Binju Wang*

J. Am. Chem. Soc., 2022, DOI: 10.1021/jacs.2c09263

导师介绍

王斌举

https://www.x-mol.com/university/faculty/243303