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内源非天然氨基酸Sulfotyrosine合成高效蛋白质药物

通过在活细胞里定点插入结构多样的非天然氨基酸(noncanonical amino acids, ncAAs),遗传编码扩展技术已经在逐渐改变我们研究生物过程以及开发生物药物的能力。该技术需要很高浓度的胞内ncAAs,这就需要外源添加更高浓度的ncAAs到培养液中,并且ncAAs还要有良好的穿膜效率。一些很重要的ncAAs拥有较强的极性或者带负电,这就导致了其低跨膜效率和低蛋白插入效率。过往的研究者们通过使用含有ncAAs的二肽或者被保护基修饰的ncAAs来提高它们的跨膜效率,但是这些方法需要依赖胞内二肽水解酶或者蛋白质纯化后化学处理来实现目标ncAAs的插入。这种ncAAs低穿膜效率的问题可以巧妙地被ncAAs的胞内生物合成来解决。酪氨酸磺酸化是一种非常重要的蛋白质翻译后修饰。为研究定点磺酸化蛋白质的功能以及制备定点磺酸化蛋白药物,遗传编码扩展技术被用来在蛋白质中定点插入磺基酪氨酸 (Sulfotyrosine, sTyr),不过因为sTyr在生理条件下带负电导致的低透膜效率,往往需要外源添加3-20 mM sTyr来达到有效胞内浓度。


为解决这类问题,美国莱斯大学Han Xiao教授课题组近日在Nature Communications 报道了可生物合成以及基因编码sTyr的原核生物细胞和真核生物细胞。他们通过序列相似性网络(sequence similarity network, SSN)发现了sTyr生物合成途径中关键的磺酸转移酶(sulfotransferase),使用生物信息学以及蛋白质计算方法分析了其独特的酪氨酸底物识别性质。令人兴奋的是,基于这种磺酸转移酶的工程真核/原核细胞可以产生位点特异性磺酸化蛋白质,sTyr插入的效率比对照细胞在外源添加最大报道量sTyr的条件下还要高。这些可以高效生物合成和基因编码sTyr的细胞可以被用来制备高亲和力的凝血酶抑制蛋白。基于此种策略,赋于细胞ncAAs生物合成能力可以提高ncAAs插入效率以及推广ncAAs的应用。

图1. 使用序列相似性网络发现酪氨酸磺酸基转移酶。


作者首先构建了基于RnSULT1A1序列相似性网络并且发现了识别p-coumaric acid的RnSULT1A1和识别dopamine的HsSULT1C2在两个不同的区域。基于以上信息,作者假设序列相似性网络中在和RnSULT1A1以及 HsSULT1C2都具有高相似度的其它序列有可能可以催化酪氨酸磺酸化。为了证明这个假设,27个序列被挑选出来,经过实验验证,他们发现了A0A091VQH7 具有酪氨酸磺酸化活性。A0A091VQH7是来自于鸟类Nipponia nippon基因组中未被证实功能的序列,作者将其命名为NnSULT1C1(图1)。


为了探究NnSULT1C1识别酪氨酸的机理,作者使用系统进化分析和多序列比对发现了NnSULT1C1中一个loop以及可能在底物结合口袋区域的氨基酸非常独特。为了研究这些氨基酸位点对其独特的酪氨酸识别的作用,作者使用AlphaFold 2准确地预测了NnSULT1C1的结构。NnSULT1C1与酪氨酸的结合也用分子对接来进行了模拟。通过比较NnSULT1C1和其它不能识别酪氨酸的蛋白质的酪氨酸结合分数与构象,作者发现了NnSULT1C1具有和酪氨酸结合的最优结合分数和构象。

图2. 构建高效生物合成sTyr的大肠杆菌。


为了提高NnSULT1C1在原核生物中生物合成sTyr的效率,作者们进行了一系列的基因改造、代谢改造以及表达条件优化。在改造后的大肠杆菌中,生物合成sTyr所达到的胞内浓度以及sTyr插入效率都比对照细胞在外源加入27 mM sTyr条件下要高。质谱分析也证明了生物合成sTyr插入目标蛋白的保真性(图2)。


除了原核生物,作者也实现了在真核细胞内sTyr的生物合成和基因编码。这是第一次在真核细胞同时实现ncAAs的生物合成和基因编码的例子。通过共聚焦显微镜和流式细胞仪,作者发现相较于外源sTyr添加条件下的野生型细胞,含有NnSULT1C1稳定表达的细胞展现了更高的胞内sTyr浓度和sTyr插入效率。


酪氨酸磺酸化修饰对于蛋白质间相互作用非常重要,尤其是凝血酶与其抑制蛋白的结合。一些自然界存在的凝血酶抑制蛋白会被翻译后修饰系统定点进行酪氨酸磺酸化修饰,这些带负电的磺酸基团与和凝血酶上带正电的结合口袋结合来提高凝血酶抑制蛋白的结合能力。作者使用优化的大肠杆菌系统表达了多种特异位点酪氨酸磺酸化修饰的凝血酶抑制蛋白,并且通过凝血酶活性实验证明了位点特异性酪氨酸磺酸化修饰的凝血酶抑制蛋白比野生型蛋白对于凝血酶有更好的抑制常数。值得注意的是,具有双位点磺酸化修饰的Chimadanin对于凝血酶的抑制常数比野生型Chimadanin降低了一百多倍(图3)。

图3. 使用生物合成sTyr的大肠杆菌制备凝血酶抑制蛋白。


与超过300个可以基因编码的ncAAs相比,只有几个可以基因编码的并且不需要外源添加前体的ncAAs生物合成途径被报道了出来。这包括了Schultz组报道的p-aminophenylalanine (pAF),Chin组报道的phosphothreonine (pThr),Xiao组报道的 5-hydroxyl-tryptophan (5HTP)、dihydroxyphenylalanine (DOPA)、O-methyl-tyrosine (OMeY) 和sulfotyrosine (sTyr)。与外源添加ncAAs相比,生物合成ncAAs不仅可以解决一些ncAAs的低透膜效率问题,还可以拓展ncAAs的应用,并且为构建一个含有ncAAs的物种提供可能。


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Unleashing the potential of noncanonical amino acid biosynthesis to create cells with precision tyrosine sulfation

Yuda Chen, Shikai Jin, Mengxi Zhang, Yu Hu, Kuan-Lin Wu, Anna Chung, Shichao Wang, Zeru Tian, Yixian Wang, Peter G. Wolynes & Han Xiao 

Nat. Commun.202213, 5434, DOI: 10.1038/s41467-022-33111-4


研究团队简介


Han Xiao教授本科毕业于中国科学技术大学化学系,师从龚流柱教授。研究生毕业于Scripps化学系Prof. Peter G. Schultz实验室,随后在斯坦福大学化学系Prof. Carolyn R. Bertozzi实验室从事博士后研究工作。其相关研究工作分别以第一作者身份发表在 PNAS, JACS, Angew等期刊,共发表共同作者文章及专利30多篇。2017年,Xiao教授加盟全美顶尖私立大学莱斯大学(Rice University)。课题组研究方向包括:生物正交化学反应、蛋白质化学修饰、蛋白进化、抗体偶联、化学生物学以及相关交叉学科。


欢迎具有相关背景的英才联系加盟。实验室主页:http://xiao.rice.edu 


文章第一作者为前莱斯大学博士生Yuda Chen,  本科和硕士毕业于南京大学生命科学学院和密歇根大学药理系,现为加州大学旧金山分校蛋白质设计方向博士后。


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