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基于Argonaute耦联指数等温扩增的可编程多重miRNA检测平台——TEAM

核酸的多重检测策略有助于精准、高效诊断疾病。例如,对多种 microRNA (miRNA) 表达水平的分析不仅为癌症的生理和病理研究提供了重要的生物学信息,而且能够应用于肿瘤的早期筛查、监测和预后。然而,由于miRNA 的固有特性,如序列短、丰度低和同源性高,导致miRNA多重检测仍然具有挑战性。CRISPR基因编辑酶在分子诊断中具有可编程、高效和精确识别的优点,被誉为“下一代分子诊断技术”,然而该酶体系存在对靶标序列PAM选择性、引导链RNA合成昂贵且易降解、多重检测反应体系复杂等局限性,限制了临床的广泛应用。Argonaute (Ago) 蛋白是一种靶向剪切DNA的基因编辑酶,它通过短DNA引导链(gDNA)对互补靶标链进行高效、精准特异性剪切,在分子诊断领域展现出巨大优势和应用前景。


本工作利用Thermus thermophilus Argonaute (TtAgo) 的剪切机制,结合指数等温扩增 (exponential isothermal amplification, EXPAR) ,建立了miRNA 的可编程多重检测平台——TEAM(Thermus thermophilus Argonaute-assisted Exponential isothermal Amplification for Multiplex detection)。传统的 EXPAR 具备高的扩增效率,但由于非特异性信号导致灵敏度有限。本工作通过将 TtAgo 的可编程性、高特异性和多周转剪切活性与 EXPAR 的高效扩增相结合,使得TEAM检测平台展现出单碱基分辨率和高灵敏度(1 aM)。TtAgo 高效剪切活性显著加快了检测过程,使总检测时间缩短至约 30-35 分钟。


多重检测技术可以提高检测效率,提供更有价值的临床信息,是精准诊断的迫切需要。TEAM 成功应用于同时检测四种结直肠癌 (CRC) 相关miRNA:miRNA-21、miRNA-92a、miRNA-31和miRNA-141。以let 7家族成员为例,TEAM方法实现对let-7a、let-7b和let-7i分型检测,证明了TEAM具有高特异性和多重检测能力,能够广泛应用于miRNAs检测领域。


TEAM成功用于检测临床血清样本中的miRNA-21、miRNA-92a、miRNA-31 和 miRNA-141,血清样本分为两组:(1)来自20名健康个体的样本(编号 1-20,正常)和(2)来自 20 名 CRC 患者的样本(编号21-40,CRC)。使用 TEAM 检测结果表明 CRC 患者的 miRNA-21、miRNA-92a、miRNA-31 和 miRNA-141 水平高于健康个体,这与文献报道一致。此外,检测miR-31 或 miR-141靶标时,TEAM 方法达到100%的灵敏度和特异性(P < 0.0001)。作为比较,作者进行了常规单重 EXPAR 和 RT-PCR 方法检测临床样品中 miR-21、miR-92a、miR-31 和 miR-141 的水平。传统EXPAR方法无法区分CRC患者和正常个体(miR-21,P = 0.0166;miR-92a,P = 0.6058;miR-31,P = 0.0799;miR-141,P = 0.6838)。RT-PCR 分析结果显示,miRNA-31 (P = 0.2651) 和 miRNA-141 (P = 0.3804) 的表达水平在正常组和CRC 组之间差异不显著。


文章的第一作者是复旦大学化学系博士研究生林秋媛,通讯作者为复旦大学化学系的陈惠副教授、孔继烈教授和上海市杨浦中心医院的翁文浩医生。


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Programmable Analysis of MicroRNAs by Thermus thermophilus Argonaute-Assisted Exponential Isothermal Amplification for Multiplex Detection (TEAM)

Qiuyuan Lin, Guobin Han, Xueen Fang, Hui Chen*, Wenhao Weng*, and Jilie Kong*

Anal. Chem., 2022, DOI: 10.1021/acs.analchem.2c01945


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