福州大学吴再生教授课题组近年来工作概览

吴再生，福州大学教授、博导，国家高层次青年人才，福建省高层次创业创新人才（百人计划），福建省闽江学者奖励计划特聘教授，福建省高校领军人才，中国化学会高级会员，现任福州大学肿瘤转移预警与预防研究所所长。2002年进入湖南大学攻读硕士、博士学位，2006年破格入职湖南大学，2008年获分析化学博士学位；2010-2014年在加拿大麦克马斯特大学做博士后研究，2014年以省特聘教授身份入职福州大学，是首届国家基金委青年-面上连续资助项目获得者和全国优秀博士学位论文提名作者。

吴再生教授在功能核酸探针、核酸纳米器件、化学生物传感及细胞内关键生物分子原位成像和癌症的诊断及靶向治疗等领域发表SCI论文130多篇，其中，Nat. Commun.、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.与Nucleic Acids Res. 或其它中科院JCR一区、二区期刊SCI论文约110篇。曾获福建省青年科技奖与湖南省化学化工会青年化学化工奖等奖项，入选河南省高等学校特聘教授，是获得加拿大麦克马斯特大学Michael G. DeGroote国际人才重点专项基金的第一位中国学者、该校健康科学院2010年年度头条新闻与常年滚动重大新闻特访专家。主持海外项目、国家级或其它级别项目20多项；是重大研究计划与重点项目等多项国家自科项目子课题负责人或骨干成员；实质性参与973计划及重大科学研究计划项目等；培养或联合培养高校科研骨干教师、博士后、硕博研究生等80多名，其中部分晋升教授、博导，并入选国家级或省级人才计划。

本文简要介绍吴再生教授课题组近几年来在功能核酸和癌症诊疗等方面所取得的新成果，其核心研究集中在癌变细胞的特异性识别、癌症的精准治疗及转移的预警和预防，以分子水平精确度调控识别探针的特异性、新型载体的药物递送能力及药物细胞内合理分布，以技术创新和科技转化在引领和支撑健康中国建设的伟大进程中做积极贡献。主要成果包括适体探针的设计、核酸纳米材料的组装、细胞成像、活体分析及靶向药物精准递送、肿瘤转移的预警及药物干预等紧密相关的几个方面。

（一）核酸纳米精简组装新技术和肿瘤细胞高精准识别新探针

（1）RCA产物自组装纳米条纹带。DNA纳米组装体具有独特的物理化学性质，DNA分子序列可编程，被视作构建纳米结构的良好材料。其中，双链DNA（dsDNA）具有相当的刚性，便于执行特定构型组装；单链DNA（ssDNA）能够折叠、具有足够的弹性，有利于功能化设计。吴再生教授课题组利用滚环扩增（RCA）产物内部有序自杂交和两条寡核苷酸侧面辅助组装，通过一步退火的简易组装过程，发展了DNA核酸纳米条纹带；而且，整个组装过程可以在金纳米颗粒表面完成，得到新型高度有序球形核壳结构Au-R2A，具有细胞靶向性内化作用，有望成为肿瘤靶向递药新载体。该DNA核酸纳米条纹带与常规DNA折纸材料相比，规避了大量脚手架DNA短链的设计和合成的繁琐过程，能够一步完成组装；尤其是，通过两条侧边辅助短链规整化作用，不仅提高了DNA纳米条纹带的自组装效率，而且提供了理想的功能化位点，可方便引入肿瘤细胞特异性识别能力的适体（aptamer）。组装体Au-R2A能有效装载抗癌药物DOX，并将其靶向递送到肿瘤细胞。该纳米药物递送体系具有良好的血清稳定性，优越的药物装载能力和良好的肿瘤靶向杀伤能力；选择装配不同的核酸适体，可实现对不同肿瘤的精准递药；在肿瘤精准治疗研究领域具有诸多应用潜力，如装载siRNA导入细胞，沉默细胞内特定蛋白的表达，或用于胞内特殊靶向物质的检测等，有望在疾病的诊断和靶向治疗发挥积极作用（Angew. Chem. Int. Ed., 2020, 59, 14584-14592）。

（2）核酸适体精准制导核酸纳米载体及癌细胞靶向递药研究。在临床上，将抗肿瘤药物高效率和高精度地传递至肿瘤靶细胞是至关重要的。非特异性吸附和脱靶效应是化疗药物向肿瘤靶细胞递送过程中经常遇到的两个棘手且又急需解决的问题。吴再生教授课题组通过巧妙设计核酸序列，构建了一种新型的DNA纳米材料精准靶向给药体系，能够高效加载化疗药并将其精确递送至特定靶细胞，实现肿瘤细胞的精准靶向治疗与体内荧光生物成像。该载药系统被命名为核酸纳米精准制导导弹递药系统（D-PGM），由两部分组成：第一部分是承担加载化疗药物的弹头系统（WH），第二部分是能够实现精准靶向的控制系统（GC）。WH作为药物加载的主体，其躯干是由横向的普通碱基杂交与纵向的回文粘性末端交联而成的三维自组装DNA纳米级材料，结构元件单一、组装快捷、载药量大。GC是由三段关联改性跟适体匹配的DNA序列组装得到的逻辑门，能够通过细胞表面锚定的适体程序性结合、启动逻辑门，实现细胞亚型特异性识别。WH系统与GC系统结合能发挥协同作用，GC逻辑门的操作类似于精密制导导弹中的制导和控制系统，将载有阿霉素（DOX）的核酸材料WH系统导向到肿瘤靶细胞，从而实现高度选择性的肿瘤化疗。此外，通过监测附着在D-PGM上荧光基团和阿霉素本身自带的荧光，能够追踪核酸纳米材料和药物在活体及靶细胞内的分布。研究结果表明，所构建的核酸纳米载药体系具有良好的生物相容性和优良的抗血清降解能力，能够在复杂的生物环境中精准地输送抗癌药物到肿瘤细胞中发挥抗肿瘤治疗作用，为核酸纳米材料靶向药物递送体系的构建以及临床应用提供方法借鉴与数据依据，尤其是核酸适体关联性DNA逻辑门的构建为特异性细胞识别和肿瘤精准诊疗提供了重要启示（J. Am. Chem. Soc., 2020, 142, 1265-1277）。

（二）细胞内生物分析原位成像核酸探针和病变细胞特异性分析

（1）目标诱导Y型DNA组装体的原位催化组装。美国著名DNA纳米科学家Nadrian C. Seeman通过Ferguson分析，发现DNA分支结构（DNA Junctions）随着分支的增加具有更低的扩散性，但DNA junctions在细胞内的相关应用却一直没有实质进展。吴再生教授课题组以三个发夹结构作为前驱体，用细胞内miRNA触发并催化组装成最简单的DNA Junctions（Y-DNA），并证明此结构在细胞内具有很低的扩散性，能在目标原位置完成组装，据此发展了miRNA分子3-HPSDA原位成像技术。相比于传统的原位杂交技术（FISH），不但3-HPSDA信号扩增效果好，具有更高的灵敏度，而且与1-HPSDA（传统的单发夹SDA）细胞成像效果相比，Y-DNA产物比1-HPSDA双链DNA产物具有大得多的扩散位阻，进而很难从细胞内清洗出来，得到了更优的成像效果。3-HPSDA技术可用于不同种类、不同表达水平的miRNAs细胞内原位成像，能特异性识别特定细胞，而且具有普遍适用性（Angew. Chem. Int. Ed., 2018, 57, 9739-9743）。

（2）三维核酸纳米器件的细胞内非酶原位生长及细胞成像。由于细胞内环境极其复杂，通过完全从原始DNA探针非酶组装的方式实时原位监测活细胞中低丰度的癌症生物标记物（如miRNAs和蛋白质）及其困难，相关研究目前仍处于探索阶段。吴再生教授课题组通过末端回文的相互作用，直接由三个DNA发夹，而不是传统的DNA中间体，完成细胞内的原位组装，得到非移动性三维DNA NS纳米球。利用该项技术在试管中可以检测到1.4 pM的目标miRNA，同源miRNAs中不同的分子可以100%地区分出来，可对细胞内miRNA进行特异性原位成像。NS纳米球在亚细胞内的位置能够被实时监测，而且该组装技术适用于细胞内肿瘤蛋白标志物的原位检测，为病理学领域生物分子功能的研究提供了很好的工具，促进疾病诊断及治疗领域的研究和应用（ACS Nano, 2020, 14, 9572–9584）。

（3）适用于活体成像的DNA环形突起盾牌保护的脱氧核酶步行器。miRNA的异常表达经常在各种癌症中被检测出来。脱氧核酶DNAzyme机器与金纳米粒子（AuNP）相结合有望高灵敏检测活细胞中的特定miRNA，但由于催化核心脆弱，其循环时间很短。通过使用miRNA-21作为模型目标，在催化核心的中间引入一个圆形凸起的DNA保护盾牌，吴再生教授课题组构建了一种自我保护的DNAzyme步行器，能够充分在底物链修饰的AuNP表面上步行，用于细胞内的miRNA成像和活体肿瘤成像。DNAzyme步行器展示出5倍增强的血清抵抗能力，催化活性提高了8倍以上，有助于对miRNA做高灵敏检测，其稳定性和灵敏度远高于商业化转染试剂和经典的FISH成像技术。而且可以通过改变目标结合域来对其他类型的miRNA进行成像。该DNAzyme步行器能够准确地区分病变细胞与健康细胞，并能在肿瘤部位有效聚集、运行发亮，进而确定癌症发病与否，是一种很有前途的癌症诊断和预后工具（ACS Nano, 2021, 15, 19211–19224）。

（三）抗降解复合纳米组装材料的组装、靶向药物载体的研发及肿瘤转移的预警和预防研究

（1）纳米金/含刚性DNA三角形外层多功能壳的核壳型结构及癌症治疗药物siRNA靶向递送体系。在癌症治疗中，抗癌药物的脱靶副作用和免疫原性等通常是药物治疗所面临的急需解决的问题。吴再生教授课题组以金纳米颗粒为核、中层自组装DNA为骨架负载siRNA、外层刚性DNA三角形为抗降解保护壳、核酸适体为靶向分子，构建了核壳型纳米结构药物载体。具体来说，以35 nm的金纳米颗粒（AuNP）为核，在纳米金表面修饰DNA单链（ADC），形成AuNP-ADC；通过与ADC靠近金表面的片段杂交，装载siRNA，而ADC外侧片段用于抗降解保护外壳的安装。外壳保护层的基本结构单元是刚性的DNA三角形，三个顶点含有相同的核酸回文片段，使基本结构单元互相交联，在外表面形成一层DNA外壳。同时，在刚性三角形的中心安装核酸适体，用于对肿瘤细胞的特异性识别，构建成纳米金内核、DNA-diRNA中层和三角形-适体外层的核壳型结构siRNA/Ap-CS。该体系通过核酸适体的特异性识别与细胞内化过程，siRNA药物能被递送到肿瘤细胞内部，细胞内的特征分子microRNA能够与ADC优先杂交，释放siRNA，以此形成刺激-响应药物释放过程，对靶标蛋白具有高效的沉默效应，产生对靶细胞的杀伤作用，在活体水平也取得了良好的肿瘤治疗效果。而且，由于siRNA/Ap-CS具有良好的生物相容性以及理想的抗血清降解能力，能够在活体水平运载siRNA药物、发挥基因调控作用而没有明显的毒性副作用（Nat. Commun., 2021, 12, 2928）。

（2）抗降解适体介导细胞靶向递药核酸纳米线。针对核酸易降解的性质，吴再生教授课题组成员通过隐藏核酸末端，构建了一个周期性排列的DNA纳米线，并在纳米线外表面组装具有细胞特异性识别能力的发夹或近似发夹结构的核酸适体，得到DNA纳米线-适体的核壳型纳米结构（NWs-Aptamer）。这种以线性长条模块组装体为核心、以末端隐藏、发夹型结构适体有序分布为保护外壳的核酸纳米线，组装简便、不需要任何化学修饰，具有表面多价适体识别效应等，在对病变细胞靶向性结合的同时，具有很强的在体抗降解作用。实验数据证明，NWs-Aptamer可以在血清中稳定存在至少24小时，在荷瘤小鼠中具有足够的时间在肿瘤部位聚集。以此为靶向递药载体，构建了肿瘤核酸诊疗探针，在荷瘤鼠动物模型中取得良好的治疗效果（Angew. Chem. Int. Ed., 2020, 59, 17540-17547）。

（3）细胞内原位组装DNA水凝胶及恶性肿瘤侵袭预判和癌症预防。DNA结构纳米技术对于研究、诊断和治疗人类疾病具有重要意义。然而很少有研究DNA结构纳米是否适用于预测肿瘤细胞的恶性侵袭和预防癌症。这主要是因为目前大多数的 DNA 模块设计复杂和纳米结构（包括 DNA 水凝胶）对核酸酶降解的敏感性，阻碍此组装技术在临床领域的应用。而且，由于技术限制，尚未探索以非常简单的方式在细胞内组装 DNA 纳米结构。吴再生教授课题组通过回文末端介导的交联杂交链反应（c-HCR），提出了仅用两个发夹探针以连续方式在细胞内侵入性生长的DNA水凝胶网络（2 h-DNH），其中DNA模块中引入的回文片段有效地简化了探针设计和组装过程。肉眼可见的2 h-DNH，在细胞内环境中孵育12小时后仍能保持其结构完整性。c-HCR策略可用于检测细胞内miRNA，检测灵敏度提高近2~3个数量级，能将病变细胞（HeLa）与健康细胞（HEK-293）区分开来，并能够识别出具有不同表达水平miR-21的MCF-7细胞。因而，即使没有临床症状，也可以通过观察细胞内2 h-DNH信号来预测恶性肿瘤细胞的侵袭与否；在c-HCR指导下的药物干预治疗能够阻碍肿瘤的发生和发展，在人类癌症的早期预警和预防中具有应用前景（Chem. Eng. J., 2022, 428, 131150）。

（四）功能核酸探针的筛选和运用

识别特定结构的核酸适体的筛选和高活性DNA分子器件的组装。Catenanes是分子工程领域独特的组装集合体，科研工作者期望每个环形组件都能够绕着另一个组件自由旋转而执行各自的特定的功能。为此，组件之间必须具有很弱的相互作用。与此同时，由于碱基序列多样性与组装的可操纵性，核酸已经成为纳米器件组装的常用生物材料。可是所报道的核酸套索环分子器件catenanes通常含有一段或多段很长的双链DNA片段，限制了组件之间的自由旋转与生物活性。为了突破研究瓶颈、实现组装目的，吴再生教授等利用核酸文库的多样性，借助胶电泳分离技术与核酸酶对核酸的加工、修饰和操纵等，发展自由运动式套索环核酸分子器件（[2]catenane）。通过核酸杂交、双链套索环合成解析与RCA反应效率考察，确认所得核酸器件环组件能够独立运转，具有足够高的生物活性，为自由组件套索环核酸分子器件的制备及高生物活性分子智能机器的设计提供了良好的示范与新的思路，不但为适体aptamer与脱氧核酶DNAzyme等功能核酸的引入提供契机，而且使智能型核酸纳米器件的构建成为可能（Nat. Commun., 2014, 5, 4279）。

导师介绍

吴再生

https://www.x-mol.com/university/faculty/9534