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武汉大学黄卫华教授团队JACS:纳米电极亚毫秒定量区分单个吞噬酶体内ROS/RNS的稳态平衡

巨噬细胞吞噬溶酶体内活性氧(ROS)和活性氮(RNS)的调控对杀伤病原体和维持细胞稳态极其重要。研究表明,吞噬溶酶体内ROS/RNS消耗后,NADPH氧化酶(NOX)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)会迅速启动O2•-和NO的补充机制。然而,该过程中两种酶对于吞噬溶酶体内高ROS/RNS杀菌活性的维持且细胞自身不受损伤的精确调控机制仍不明确。


近日,武汉大学黄卫华教授(点击查看介绍)课题组报道了一种新型的铂纳米线电极(SiC@Pt NWE),实现了单个吞噬溶酶体内ROS/RNS亚毫秒级定量区分检测(图1)。通过在SiC纳米线(SiC NW)表面包覆高密度的小粒径(3 nm)铂纳米颗粒,实现了电极对4种ROS/RNS(ONOO-H2O2,NO和NO2-)的高灵敏区分(图2)。随后,作者结合电位区分和胞内囊泡碰撞电化学计数法(intracellular vesicle impact electrochemical cytometry,IVIEC),检测了不同电位下吞噬溶酶体内含物在电极表面迅速氧化产生的峰状电流信号。

图1. (A)两步化学还原法制备SiC@Pt NWs;(B)SiC@Pt NWE的制备及其用于吞噬溶酶体内4种ROS/RNS的定量区分检测。


图2.(A,B)SiC@Pt NWs的SEM和TEM图;(C)SiC@Pt NWE的SEM图;(D)电极绝缘前后检测1 mM Ru(NH3)63+的CV图;(E)SiC@Pt NWE重复检测100圈1 mM Ru(NH3)63+的CV图;(F)SiC@Pt NWE对4种ROS/RNS的归一化LSV图。


高电位条件下,高比例的峰信号在下降阶段出现异于传统信号的拖尾“肩峰”。这种“肩峰信号”表明吞噬溶酶体可能存在快速的(<1 ms)ROS/RNS稳态调控机制,即在电极表面氧化消耗的同时,NOX和iNOS迅速补充新生的ROS/RNS。实验结果发现,在+800 mV(ONOO- + H2O2 + NO + NO2-)和+600 mV(ONOO- + H2O2 + NO)时,分别有75%和65%的峰信号出现“肩峰”,而+500 mV(ONOO- + H2O2)时只有不到10%的“肩峰”信号。这一结果表明“肩峰”补充的ROS/RNS主要来自于iNOS新生的NO。通过对单个峰信号建模拆分,作者分别对储存(图3B 绿色区域)和新生(图3B 橙色区域)的ROS/RNS进行定量分析。结果表明,吞噬溶酶体内储存约95%的RNS物质(ONOO-,NO和NO2-),且每种物质占比约30%;而在ROS/RNS新生成阶段,NO占比高达80%。

图3.(A)不同检测电位下正常峰和肩峰的占比;(B)SiC@Pt NWE定量监测单个吞噬酶体释放储存和新生ROS/RNS的原理示意图;(C,F)储存和新生ROS/RNS电量的分布;(D,G)储存和新生ROS/RNS的电量的统计;(E,H)储存和新生ROS/RNS的定量转化关系。


随后,作者进一步探讨该实验现象背后的酶调控过程。NOX是一种暂态酶,组装后只能维持几分钟的活性,而iNOS则可长时间(几小时到几天)处于激活状态。因而,当吞噬溶酶体内ROS/RNS耗竭后,部分组装的NOX在亚毫秒水平只能产生少量的O2•-(约占20%),而持续性激活的iNOS则迅速补充大量NO(约占80%)。在长时间的储存阶段,O2•-和NO会进一步的转化为其他ROS/RNS。在此过程中,大量的NO会反过来抑制NOX的活性,避免过多的含氧自由基生成,同时ONOO-会转化为更稳定的NO2-,降低ONOO-的损伤性(图4)。

图4.(A-C)4种ROS/RNS和前体的总量、储存和新生成量的占比图;(D)NOX和iNOS稳态调控及ROS/RNS转化机理图。


综上所述,该工作制备了一种对ROS/RNS具有高电催化活性和高选择性的新型Pt纳米线电极,实现了对单个巨噬细胞吞噬溶酶体内储存和新生的多种ROS/RNS的分别定量。该工作监测了NOX和iNOS在病原杀伤过程的不同动力学差异,阐明了巨噬细胞高ROS/RNS杀菌活性维持且自身无损的精准调控机制,为深入研究不同生理病理条件下免疫细胞ROS/RNS稳态调控和相关酶的动力学调节过程提供了重要的定量依据。


这一研究成果近期发表在J. Am. Chem. Soc.上,武汉大学博士研究生齐昱婷是文章的第一作者,黄卫华教授和法国巴黎高师Christian Amatore教授为共同通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金项目的资助。


近年来,应对单/亚细胞水平重要活性分子实时动态监测的需求,武汉大学黄卫华团队发展了一系列基于单根纳米线材料的纳米电化学传感器。该团队在单根SiC纳米线表面,通过气相沉积碳层  [1]水相合成PEDOT聚合物薄膜  [2] 和化学沉积贵金属薄膜  [3] 等方法,构建了一系列高性能电极界面基底材料。此外,该团队也提出多种修饰电极构建策略。通过在电极表面共价结合酶等生物单元,实现了高选择性纳米酶电极的制备,将检测目标物拓宽到非电化学物质 [4,5]。为解决修饰不可控和不稳定的问题,团队提出了水相批量合成包覆有仿生催化分子纳米线的通用方法,成功构建了一系列选择性强、催化性能高的修饰电极  [6]。在此基础上,团队在单/亚细胞水平成功实现了葡萄糖、谷氨酸、ROS/RNS、GSH、NADH等多种生物活性分子的实时原位监测,获取了神经元胞吐模式[5]、吞噬溶酶体ROS/RNS稳态机制  [1,3,7]、细胞抗氧化应激途径  [6]、以及抗癌药物作用机理  [8,9] 等细胞生命过程的新认知。相关工作为在单/亚细胞水平深入研究生理和病理过程、揭示疾病发生发展机制、促进个体化诊疗以及药物筛选等提供了新思路和新方法。


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Homeostasis inside Single Activated Phagolysosomes: Quantitative and Selective Measurements of Submillisecond Dynamics of Reactive Oxygen and Nitrogen Species Production with a Nanoelectrochemical Sensor

Yu-Ting Qi, Hong Jiang, Wen-Tao Wu, Fu-Li Zhang, Si-Yu Tian, Wen-Ting Fan, Yan-Ling Liu, Christian Amatore*, and Wei-Hua Huang*

J. Am. Chem. Soc., 2022, DOI: 10.1021/jacs.2c01857


导师介绍

黄卫华

https://www.x-mol.com/university/faculty/13594 


参考文献

[1] Zhang, X. W.; Qiu, Q. F.; Jiang, H.; Zhang, F. L.; Liu, Y. L.; Amatore, C.; Huang, W. H. Real-time intracellular measurements of ROS and RNS in living cells with single core-shell nanowire electrodes. Angew. Chem., Int. Ed201756, 12997-13000.

[2] Wu, W. T.; Jiang, H.; Qi, Y. T.; Fan, W. T.; Yan, J.; Liu, Y. L.; Huang, W. H. Large-scale synthesis of functionalized nanowires to construct nanoelectrodes for intracellular sensing. Angew. Chem., Int. Ed202160, 19337-19343.

[3] Qi, Y.T.; Jiang; H. Wu, W. T.; Zhang F. L.; Tian S. Y.; Fan, W. T; Liu, Y. L.; Amatore, C.; Huang, W. H. Homeostasis inside Single Activated Phagolysosomes: Quantitative and Selective Measurements of Submillisecond Dynamics of Reactive Oxygen and Nitrogen Species Production with a Nanoelectrochemical Sensor. J. Am. Chem. Soc2022, DOI: 10.1021/jacs.2c01857

[4] Liao, Q. L.; Jiang, H.; Zhang, X. W.; Qiu, Q. F.; Tang, Y.; Yang, X. K. Liu, Y. L.; Huang, W. H. A single nanowire sensor for intracellular glucose detection. Nanoscale 201911, 10702-10708.

[5] Yang, X. K., Zhang F. L.; Wu, W. T.; Tang, Y.; Yan, J.; Liu, Y. L.; Amatore, C.; Huang, W. H. Quantitative Nano-Amperometric Measurement of Intravesicular Glutamate Content and of its Sub-Quantal Release by Living Neurons. Angew. Chem., Int. Ed202160, 15803-15808.

[6] Wu, W. T.; Chen, X.; Jiao Y. T.; Fan, W. T; Liu, Y. L.; Huang, W. H. Versatile Construction of Biomimetic Nanosensors for Electrochemical Monitoring of Intracellular Glutathione. Angew. Chem., Int. Ed202261, e2021158

[7] Zhang, X. W.; Oleinick, A.; Jiang, H.; Liao, Q. L.; Qiu, Q. F.; Svir, I.; Liu, Y. L.; Amatore, C.; Huang, W. H. Electrochemical monitoring of ROS/RNS homeostasis within individual phagolysosomes inside single macrophages. Angew. Chem., Int. Ed201958, 7753-7756.

[8] Jiang; H.; Zhang, X. W.; Liao, Q. L.; Wu, W. T.; Liu, Y. L.; Huang, W. H. Electrochemical Monitoring of Paclitaxel‐Induced ROS Release from Mitochondria inside Single Cells. Small 201915, 1901787

[9] Jiang; H.; Qi, Y.T.; Wu, W. T.; Wen M.Y.; Liu, Y. L.; Huang, W. H. Intracellular monitoring of NADH release from mitochondria using a single functionalized nanowire electrode. Chem. Sci202011, 8771-8778.


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