基于单颗粒表面限域酶促反应机制的数字式流式微球分析方法

在单分子水平检测酶等生物分子的含量、活性等信息可为深入阐释超微量生物分子及其异质性与疾病发生发展之间的关联提供第一手数据，对于生命医学研究具有非常重要的意义。近年来，数字式（digital）生化分析方法在超微量生物分子检测等领域展现出了独特优势。与传统基于检测整个溶液体系中平均信号（analog）的均相分析方法相比，数字式检测模式不仅能在单分子水平上准确检测包括酶在内的多类生物分子，而且能够提供精确的分子间异质性信息。因而以微滴数字PCR（ddPCR）和单分子阵列（Simoa）检测系统为代表的数字式检测方法已成为生物医学研究领域的重要分析工具。然而，现有的数字式分析技术往往需要依赖大量的微乳液滴或微孔阵列等微反应室来隔离单个目标分子及其后续的扩增信号，微乳液滴、微孔阵列及相关后续反应需要专业的微加工技术和专门的仪器设备，一定程度限制了数字式检测方法的广泛推广。针对相关问题，陕西师范大学刘成辉教授（点击查看介绍）团队曾在前期研究中，通过在微球表面引入单分子诱导的荧光信号放大机制，利用生化实验室普遍配备的常规流式细胞仪对荧光阳性微球进行数字式计数，开发了无需依赖微乳液滴及微孔阵列的数字式流式微球核酸检测方法（Chem. Commun., 2020, 56, 7179−7182）。但该体系中靶标核酸分子以及随后的信号放大反应必须固定在微球表面，因此无法推广至酶活性的数字式检测。

近日，刘成辉教授团队报道了一种无需封闭式微反应室的数字式流式微球检测体系，并成功用于T4多聚核苷酸激酶磷酸酶（T4 PNKP）活性的超灵敏数字式检测。作为一种双功能酶，T4 PNKP同时具有5'激酶活性和3'磷酸酶活性。该团队经系统研究发现无论是T4 PNKP的磷酸酶还是其激酶特性，均对负载在微球表面的DNA底物展现出独特的单颗粒表面限域催化反应行为，即当T4 PNKP分子数目远少于负载DNA底物的微球数目时，单个T4 PNKP分子将空间自限域地仅与单一微球表面的底物进行反应，而不会发生跨越多个微球的随机反应。这为构建不依赖于微乳液滴和微阵列的新型数字式酶检测体系提供了新的途径。

图1. 基于自限域酶促反应机制的数字式流式微球体系检测T4 PNKP原理示意图

如图1所示，以检测T4 PNKP的磷酸酶活性为例，在微球表面负载适当密度的3'-磷酸化的单链DNA作为T4 PNKP的底物。当T4 PNKP数目少于微球数目时，根据泊松分布，只有少部分微球可以承载T4 PNKP分子，进而每个T4 PNKP将分别自限域在所接触的单个微球表面并逐步催化DNA底物的去磷酸化反应，直到其所在微球表面的3'-磷酸化DNA底物被消耗殆尽。在后续反应中，末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）可以识别微球上酶促反应暴露出的底物3'-OH末端，并通过在3'-OH末端连续添加dTTP形成poly(T)长链，进而捕获大量荧光分子标记的互补寡核苷酸探针，使搭载T4 PNKP的微球表面聚集大量的荧光信号。相比之下，未承载T4 PNKP的微球表面的DNA底物3'-末端依然为磷酸基团，无法被TdT识别和延伸，因此不会产生荧光信号。最后，利用常规的流式细胞仪对荧光阳性的微球进行统计，即可实现T4 PNKP的灵敏数字式检测（结果见图2）。

图2. 数字式流式微球体系的分析性能。(a) 不同浓度T4 PNKP时微球的FSC vs FL1散点图。(b) 基于数字信号读出模式的阳性微球比例与T4 PNKP浓度之间的标准曲线。(c) 高浓度T4 PNKP时微球的Counts vs FL1直方图。(d) 高浓度T4 PNKP时，微球平均荧光信号与T4 PNKP浓度之间的标准曲线。(e) 数字信号检测模式和平均信号检测模式在检测低浓度范围T4 PNKP时的灵敏度对比。

得益于T4 PNKP自身独特的微球表面自限域反应特性及数字式信号读出模式的优势，该方法的检出限可达到1.28 × 10^-10 U/μL，是迄今为止最灵敏的T4 PNKP检测方法之一，在低浓度T4 PNKP精准检测方面展现出了传统平均信号输出模式所无法比拟的优势。更重要的是，这种基于T4 PNKP独特的自限域反应特性的数字式检测方法可以轻易消除复杂基质中可能存在的各类磷酸酶、核酸酶等能与DNA底物非特异性作用酶类所产生的干扰，展现出了超强的特异性和可靠性。

刘成辉教授团队在文中指出，以T4 PNKP作为酶标记物取代临床生化检测中常用的碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶等标记酶，通过合理构建竞争型或非竞争型免疫检测体系，基于T4 PNKP自身特性的数字式检测模式有望扩展至如数字ELISA等多种类生物分子的数字式分析，为构建新一代的非微乳液滴、非微孔阵列依赖型的数字式检测平台提供了全新的思路。

这一成果近期发表在Analytical Chemistry 上，文章的第一作者是陕西师范大学硕士研究生张莉君，通讯作者为陕西师范大学刘成辉教授。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Microchamber-Free Digital Flow Cytometric Analysis of T4 Polynucleotide Kinase Phosphatase Based on Single-Enzyme-to-Single-Bead Space-Confined Reaction

Lijun Zhang, Wenjiao Fan, Dailu Jia, Qinya Feng, Wei Ren, and Chenghui Liu*

Anal. Chem., 2021, 93, 14828–14836, DOI: 10.1021/acs.analchem.1c03724

导师介绍

刘成辉

https://www.x-mol.com/university/faculty/12383