Angew. Chem. ：使用MspA纳米孔监测蛋白质构象转换- X-MOL资讯

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Angew. Chem. ：使用MspA纳米孔监测蛋白质构象转换

作者：X-MOL 2021-10-03

蛋白质在参与机体的生理过程中常伴随着构象的改变。观察蛋白质在溶液环境的构象变化和相互作用有助于理解其运行机制且非常具有挑战性。相比于对体系内总体平均的结果进行分析的集成方法，时间解析的单分子分析技术在研究单个蛋白质的过渡瞬态和复杂的功能机制等方面更具优势。

单通道纳米孔分析技术正在成为无标签实时分析单个蛋白质的有力工具。它微秒级的时间尺度非常适合蛋白质结构变化的高分辨监测。通过分析单一的蛋白质被捕获后产生的电流封锁及其对应的事件时间即可实时反映蛋白质的活动过程。近年来，一系列生物纳米孔例如溶细胞素A（ClyA），曲霉毒素C（FraC）和胸膜溶素AB（PlyAB）已被证明可用于研究蛋白质的多种结构动力学。这些生物孔道都具有较大容积的空腔可以完全容纳蛋白质分析物，且都经过了一定的工程改造以增加对蛋白质的捕获效率，这对于纳米孔自身的形状和结构稳定性有较高的要求。

最近，南京大学黄硕团队报道了一种新的检测方案，使用锥形的耻垢分枝杆菌膜蛋白A (MspA)作为纳米陷阱在部分容纳待测蛋白的状态下对其结构进行分析。MspA具有易改造和制备、稳定性强的优点，此前已经被成熟应用于DNA测序、单分子化学和纳米孔力谱等方面。该篇工作首次系统地将MspA用于蛋白质-配体结合以及病理学突变相关的蛋白构象变化的无标记检测，展现出了极佳的灵敏度和分辨率。

该工作选择钙调素（CaM）作为该策略的研究对象，对其三种构象异构体进行了全面的实验表征，证明了MspA纳米孔势阱能够直接区分钙调素的构象变化。同时，作者首次从单分子尺度发现心脏病相关的病理学突变CaM-D129G能够引起结合钙离子的能力下降，进而发生不完全别构，导致钙调素功能的失调。

作者还评估了不同离子(Mg²⁺/Ca²⁺/Sr²⁺/Ba²⁺/Pb²⁺)对钙调素功能的竞争关系，通过实时监测离子结合产生的不同别构状态之间的比例进行了系统的单分子研究，获得了结合能力的排序。值得注意的是，钙调素与金属离子充分结合时具有相同的结构，表现为平均阻孔电流相似，但仍然可用阻塞电流波动差异很好地区分开，证明不同离子结合钙调素后蛋白质结构波动不同，这是本研究中首次报道的一种现象。最后，作者使用MspA实时检测了由Tb³⁺结合引起的钙调蛋白的聚集过程并与Ca²⁺对比，首次捕获到了钙调素和Tb³⁺结合的一个中间态，揭示了Tb³⁺作为Ca²⁺的荧光替代物用于研究钙结合蛋白的局限性。该工作证明了MspA作为传感器对蛋白质结构变化的高度敏感性和巨大潜力，为纳米孔蛋白质分析提供了新选择。