可在活细胞内表达并持续检测四磷酸鸟苷的RNA基荧光探针

注：文末有本文科研思路分析

上个世纪六十年代末，Michael Cashel教授首先发现了四磷酸鸟苷（又称“魔斑”）在大肠杆菌中对RNA聚合酶的应激调控作用。随着半个多世纪的深入研究，四磷酸鸟苷在细菌体内的广泛性和多样性调控作用也被逐步发掘。由于其代谢机制与应激反应密切相关，任何微小的环境变化都可能导致四磷酸鸟苷在细菌体内的含量产生明显波动，这也给对其进行实时监控以及其他相关的生理现象研究带来了极大的困难。迄今为止，所有已知的检测手段都是基于在体外对溶液或细胞裂解液的分析。如何在活细胞中进行对四磷酸鸟苷的可持续检测成为了研究众多生理现象所需要攻克的重要一环。

近年来，RNA适配体作为一种可基因编码的生物工具，在探针领域，尤其是活细胞检测中取得了飞速发展并引起了广泛关注，并有取代荧光蛋白成为更优的可遗传特异性表达荧光探针的趋势。在深入研究了四磷酸鸟苷特定的核糖开关的序列和结构后，马萨诸塞大学尤明旭教授和Peter Chien教授团队将部分该核糖开关序列与改良过的适配体Broccoli序列整合在了一起，构建了一种可以在活细胞内表达并持续检测四磷酸鸟苷含量的荧光探针。

由于四磷酸鸟苷被认为与细菌生存环境中的营养成分含量相关，作者将转化过并含有探针序列的大肠杆菌细胞置于不同营养条件下进行成像，不仅成功检测到了应激条件下与非应激条件下细胞内四磷酸鸟苷含量的不同，并且首度观察到了同样条件下细胞与细胞之间的个体差异。

与此同时，作者还通过该探针完成了对四磷酸鸟苷在活细胞内代谢的动力学研究。在研究时作者发现，在应激条件下，虽然大部分细胞显示出了较快的四磷酸鸟苷代谢速率，但仍有少部分细胞代谢较慢。这一现象也进一步证实了细胞内四磷酸鸟苷的代谢和含量存在较大的个体差异。

在该工作中，尤明旭教授和Peter Chien教授团队将核糖开关与RNA荧光适配体相结合，发展了一种可持续的、可对单个活细胞内四磷酸鸟苷含量进行监测的生物工具，实现了四磷酸鸟苷从体外检测到体内监测的跨越，这也是首例“看”到细胞内“魔斑”的报道。这一生物工具为众多与四磷酸鸟苷相关的科研项目提供了突破性的研究方法。

这一成果近期发表在Angewandte Chemie International Edition 上，文章的第一作者是马萨诸塞大学博士研究生孙志宁。

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Live-Cell Imaging of Guanosine Tetra- and Pentaphosphate (p)ppGpp with RNA-based Fluorescent Sensors

Zhining Sun, Rigumula Wu, Bin Zhao, Rilee Zeinert, Peter Chien, Mingxu You

Angew. Chem. Int. Ed., 2021, DOI: 10.1002/anie.202111170

导师介绍

尤明旭

https://www.x-mol.com/university/faculty/49888 

科研思路分析

Q：这项研究最初是什么目的？或者说想法是怎么产生的？

A：这项研究的目的是为了实现四磷酸鸟苷在活体细菌内的成像。虽然从四磷酸鸟苷被发现至今已过去了半个多世纪的时间，但人们对其的分析还停留在体外的检测上。这种体外分析缺乏时空分辨率、可持续性、以及对个体差异的认知。我们希望通过这种体内荧光检测的方式为相关的项目研究提供突破性的可靠的分析工具。

Q：研究过程中遇到哪些挑战？

A：本项研究中最大的挑战是如何确保荧光探针的正确折叠方式，找到优化的核糖序列，以获得高效的、灵敏的、具有特异性的探针。在这个过程中，我们团队在设计荧光核糖探针方面的经验积累起了至关重要的作用。此外，这项研究属于交叉学科的研究，其中需要不少微生物学方面的背景知识，Peter Chien团队和我们形成了十分有效的知识互补。我们希望未来能与更多相关领域的研究者一起合作将四磷酸鸟苷的研究推动到更高的层次。

Q：该研究成果可能有哪些重要的应用？哪些领域的企业或研究机构可能从该成果中获得帮助？

A：该探针是首例成功实现活体内检测四磷酸鸟苷的生物工具，其对进一步研究了解细菌生理机理的帮助不言而喻。在与之相关的领域中，如对菌膜生成、细菌持久性、以及抗生素的抗药性等研究上都可以起到重要的推动作用。