β-淀粉样肽控制供体-受体Stenhouse加合物的转换行为

分子转换的操纵可用于在生物和材料系统中的功能调控。供体（Donor）-受体（Acceptor）Stenhouse 加合物（Adduct）（DASA）是一类可转换的光致变色分子，然而自1870年首次发现以来，长期以来一直被忽视。直到2014年，de Alaniz等人系统研究了这种新型有机光致变色分子的合成方法、性质和应用。随后由于其可被低能量可见光调控开-关的功能，在材料科学及生物医学研究领域吸引了许多科学家来进行研究。相比于传统的紫外光响应的分子，用可见光或近红外 (NIR) 光照射可以诱导DASA从线性到环状异构化，而在特定溶剂中避光条件下加热时会发生环状到线性结构的恢复。值得注意的是，从强烈颜色的线性三烯结构到无色两性离子（环合）结构的分子收缩，伴随着波长和溶解度的巨大变化。2016年诺贝尔化学奖获得者Ben L. Feringa等人提出DASA光致变化的相关机理，并通过实验和计算结果得到了证实。尽管光照射是实现 DASA 切换最常用的方法，但光照在极性质子溶剂中控制DASA的能力非常有限。据报道，在甲醇和水等质子溶剂中，环状两性离子（环合）结构在加热/或黑暗中稳定，无法再转化为开链结构，因为水分子可能与 DASA 配位并稳定了环合的中间体。Feringa研究组也曾观察到避光条件下从线性到环合结构的背景反应。因此在生理环境（PBS或水）中控制DASA的变化过程是非常具有挑战性的。在体内实现光开关非常困难，因为光在体内的穿透能力非常有限。因此如何在没有光的情况下利用生物肽/蛋白来改变开关速率变得非常重要。如果多肽/蛋白质的调控是可行的，则意味着在未来的研究中可以避免组织(体内)的光穿透限制，将为生理环境中的生物转化打开新的窗口。

近日，哈佛大学医学院麻省总医院冉崇昭教授、耶鲁大学郑超副研究员、加州大学莫塞德分校施良助理教授的团队基于β-淀粉样蛋白（Aβ）物种的性质设计并合成了DASA化合物SHA-2，并通过实验及分子动力学模拟证明了Aβ40多肽可以减缓DASA化合物SHA-2的分子转换行为，研究结果表明，蛋白质中的疏水微环境可以用来减缓DASA的转换行为。该研究为在生物学相关环境中研究DASA分子开关打开了一条新的通路。相关成果发表在国际化学权威杂志Analytical Chemistry 上。

迄今为止，已经研究了三代DASA化合物的红外和紫外吸收光谱；然而这类化合物的荧光光谱很少见到报道，在本研究中，作者提供了更多关于DASA荧光性质的细节。为了获得最大发射和吸收落入近红外波长范围（640 - 900 nm）的DASA化合物，作者采用了标准的DASA合成路线，其中，羟基吡啶酮作为受体通过Knoevenagel缩合与糠醛结合，然后选择2-甲基二氢吲哚作为供体部分。通过这种方法，可以很容易地获得第三代DASA化合物SHA-2。考虑到荧光化合物的发射波长总是比激发波长长，合理的推测 SHA-2 的荧光发射波长将落在近红外窗口（640-900 nm）内。作者发现 SHA-2 在水溶液中的激发波长为 680 nm，该波长来源归属于A1。值得注意的是，荧光强度在 10 分钟内迅速减弱。此外，发光峰逐渐红移从680 nm至720 nm，该现象与Feringa小组报导的DASA化合物的紫外吸收实验及作者使用密度泛函理论 DFT 计算结果一致。作者推测，从 680 nm 到 720 nm 的红移可能是由于 A1 异构化为 A2 或 A3，它们可能具有接近的发射波长，实验过程中荧光强度继续降低，直到稳定。作者的荧光实验现象表明，中间体A1 可以通过中间体 A2 和 A3 在水溶液中快速转化为封闭形式 B。

图1. Aβ肽减缓 DASA（SHA-2）分子转换的假设。

图2. (a) SHA-2 的合成路线；(b) SHA-2 在 DCM 和 PBS 溶液 (10 μM) 中的吸收和荧光；(c) PBS 缓冲液 (2.5 μM) 中 SHA-2 的荧光随时间的变化；(d) 在 PBS 缓冲液（2.5 μM，1 当量）中，SHA-2 与 Aβ40 单体的荧光随时间的变化；(e) 0 分钟时含有和不含 Aβ40 单体的 SHA-2 的荧光（2.5 μM，1 当量）；(f) 不同 SHA-2 溶液的动力学拟合结果；(g) 带有和不带有 Aβ40 单体（2.5 μM，1 当量）的 SHA-2 溶液的光谱红移。

作者推测疏水性水溶液中的微环境可能有利于稳定 A 构象。Aβ40是阿尔茨海默病的特征多肽，其疏水片段 Aβ17-24 对其聚集起着至关重要的作用。当作者用 Aβ40 单体孵育 SHA-2 时，680 nm 处的荧光强度明显增加（2倍）（图2e），表明 Aβ40 可以与线性形式的 SHA-2结合。但随着培养时间的增加，增加的强度逐渐降低。从图2c、d可知，10 分钟后，强度与没有 Aβ40 单体的溶液相似。作者假设 680 nm 处的强度下降意味着一些构象A 消失，推测在 Aβ40 单体存在下荧光强度的下降速度可能会更慢。利用有/没有肽系统（图2c、d）的 SHA-2 荧光峰强度的降低来量化强度变化率，作者基于单相指数衰减的解离进行了动力学建模，结果表明SHA-2 在 PBS 中的衰减半衰期分别为 1.4 ± 0.0 分钟，在 Aβ40 单体中为 2.1 ± 0.0 分钟。当在不同时间点监测发射峰时，注意到 Aβ的存在可以减缓红移（图2g）。这种现象表明 SHA-2 与 Aβ40 单体内的疏水环境结合。上述结果表明 Aβ40 单体可以使 SHA-2的A构象更加稳定，并且可以与 Aβ40 单体的疏水口袋结合。因此，该结合会导致 SHA-2 从线性形式到环合形式的转换速度减慢。

为了进一步证明 SHA-2 可以与 Aβ40 物种提供的疏水微环境相互作用，作者使用了两种方法：表位结合实验和分子动力学（MD）模拟。表位改变实验和 MD 模拟都表明SHA-2 确实与 Aβ40 稳定结合，并且疏水相互作用和氢键起了重要贡献。

接着，为了阐明该结合如何改变 SHA-2 结构变化，作者分别计算了与Aβ40结合或水溶液中溶剂化的SHA-2 中 1−2−3−4 和 2−3−4−5 的二面角分布。SHA-2 与 Aβ40 单体结合后的二面角主要代表 A2 构型，其中二面角 1-2-3-4 主要采用顺式构型，而二面角 2-3-4-5 主要保持在反式构型。相比之下，当 SHA-2 在水溶液中溶剂化时，所有异构体 A1、A2 和 A3 都可以通过主要构型A3进行热力学转化获得的。尽管不同的力场可能会给出不同的二面角分布，但预计A2在与 Aβ40 单体结合后仍然是线性 SHA-2 的主要构型，因为它允许在能量上有利的氢键（两个氢键）和 SHA-2和Aβ40上Phe19a氨基酸残基之间的疏水 π-π 相互作用。SHA-2以A2形式与Aβ40的结合稳定 SHA-2 的开链结构，阻止其转换为闭环结构。总而言之，以上数据表明 SHA-2可以通过与疏水微环境和氢键的相互作用与Aβ40结合。

图3. SHA-2 二面角 1−2−3−4 和 2−3−4−5 的一维 (1D) 和二维 (2D) 分布。(a) SHA-2 溶于水。对应于线性 SHA-2 不同异构体（A1、A2 和 A3）的典型区域在二维分布中表示。(b) SHA-2 与 Aβ40 单体结合。

随后作者通过平板成像、组织切片染色和光照射实验来验证 Aβ40物种调控 DASA变化。为了探索更复杂的蛋白体系减缓DASA 分子转换行为的可能性，作者将多肽系统扩展到Aβ40寡聚体和Aβ40聚集体。当将 SHA-2 与 Aβ40 聚集体和 Aβ40 寡聚体一起孵育时，正如预期的那样，荧光强度分别明显增加了 7 倍和 4 倍（图4a）。与 Aβ40单体相同，随着孵育时间的增加，增加的强度逐渐降低（图4a-c）。作者将孵育有SHA-2或Aβ40物种结合SHA-2的溶液，在不同时间点分别通过荧光成像系统（IVIS）成像验证了Aβ40物种可以显著延迟SHA-2荧光的消失，进一步表明Aβ40可以减缓从线性A结构到环合的B结构的转化。为了进一步研究生物相关环境中 SHA-2 和 Aβ40 物种之间的相互作用，作者首先对来自 APP/PS1 转基因小鼠的脑切片进行染色。如图4e 中的显微图像所示，SHA-2 可以特别突出 Aβ40 斑块。为了测试 Aβ40 物种是否可以减缓SHA-2的关闭过程，作者使用绿光照射图4e 中的切片（10分钟），然后比较了斑块中和背景区域中化合物之间荧光强度的差异。与斑块上的 SHA-2 相比，斑块外更多的 SHA-2 转化为B。数据表明 Aβ40 物种可以减缓 SHA-2 在生物相关环境中的异构化过程。

图4. Aβ40 物种减缓 DASA 的转换。(a) SHA-2 在 Aβ40 寡聚体 PBS 溶液（2.5 μM，1 当量）中 10 分钟之间的荧光；(b) SHA-2 在 Aβ40 聚合 PBS 溶液（2.5 μM，1 当量）中 10 分钟之间的荧光；(c) SHA2/SHA-2+Aβ40低聚物/SHA-2+Aβ40聚集体在0分钟时的荧光比较和不同SHA-2溶液的动力学拟合结果；(d) 有或没有 Aβ40 种类 (2.5 μM) 的 SHA2 (5 μM) 的 IVIS 96孔板成像；(e) 用 SHA-2 (250 nM) 染色的 APP/PS1 小鼠脑切片；(f) 绿光照射组织 10 分钟后的信噪比 (SNR)。

作者通过实验和计算系统研究了Aβ40物种可以改变SHA-2的异构化过程。另一方面，作者还研究了 SHA-2 与 Aβ40 物种的结合对于 Aβ40 结构的改变。通过分子动力学模拟Aβ40单体在水中的二级和三级结构，作者发现SHA-2的结合对Aβ40单体的二级结构几乎没有影响，而其三级结构被显著改变。为了进一步分析结合和不结合 SHA-2 的 Aβ40的三级结构，作者计算了 Aβ40 和 Aβ40-SHA-2 中残基的均方根波动 (RMSF)，重原子接触数量及回转半径（Rg）。几种计算结构都表明SHA-2 的结合极大地影响了 Aβ40单体的三级结构，但不影响其二级结构。类似的三级结构改变曾报导在一些Aβ40聚集抑制剂与Aβ40单体的结合的研究中，这表明 SHA-2 可能表现出抑制Aβ40 聚集的活性。

图5. (a) Aβ40 二级结构与所有四个模拟的平均值和误差线的比较。(b) Aβ40 单体（红框）和 Aβ40-SHA-2（蓝框）的代表性 MD 快照。从白色到红色的蛋白质颜色表示表示疏水性最低到疏水性最强的区域，从 Glu22 到 Ala30 的环分别用蓝色和红色虚线圈出，用于 Aβ40 和 Aβ40-SHA-2 系统。N 和 C 末端为海洋色和洋红色。(c) Aβ40 和 Aβ40-SHA-2 复合物的特定残基均方根波动 (RMSF)。当与 SHA-2 结合时，灰色阴影区域代表 Aβ40（Glu22 到 Ala30）上波动最大的区域。(d) 在所有四个模拟中的平均 RMSF，其中 SHA-2 在 Glu22 到 Ala30 的相似区域与 Aβ40 结合。误差棒代表四个模拟的标准偏差。(e, f) 分别为 Aβ40 和 Aβ40-SHA-2 系统的重原子接触和回转半径的二维直方图

通过上述研究结果，作者推断SHA-2 可以抑制 Aβ40 单体聚集。作者分别在黑暗中在没有和有 SHA-2 的情况下孵育 Aβ40 单体。1 天后，通过SDS-PAGE 分析，再进行银染。作者发现在黑暗中 SHA-2 可以抑制Aβ40 单体聚集（图6）。作者还用硫磺素 T (ThT) 检测了这些孵育溶液中 Aβ40 聚集体的数量。避光条件下有SHA2 的 Aβ40 溶液的强度明显低于没有 SHA-2 的对照组 Aβ40 溶液（图6b)。为了进一步验证假设，作者进行了浓度依赖性实验。Aβ40溶液的ThT荧光强度随着抑制剂SHA-2浓度的增加而降低（图6C）。此外，肽溶液用淀粉样蛋白特异性荧光染料 ProteoStat 染色。该试剂先前已被证明可促进活细胞中淀粉样蛋白聚集体的特异性和灵敏检测。然后采用共聚焦显微镜检测聚集体的存在；加入SHA-2的样品荧光强度明显降低，而未加入SHA-2的样品可以看到明显的聚集体（图6d)。这些数据表明SHA-2 可以显着抑制聚集体的形成。

图6. 抗聚集实验。(a) SDS-PAGE 凝胶验证 SHA-2 在黑暗条件下抑制 Aβ40 聚集 (2.5 μM) 左侧是没有 SHA-2 的 Aβ40；右边的两个样本是带有SHA-2的Aβ40；右侧为银染平均灰度对比图。(b) SHA-2 (2.5 μM) 的验证抑制 Aβ40 (2.5 μM) 聚集，具有 ThT (2.5 μM) 荧光。(c) SHA-2 的验证在不同 SHA-2 浓度下抑制 Aβ40 (2.5 μM)，具有 ThT (2.5 μM) 荧光。(d)使用 proteostat 聚集检测试剂盒验证SHA-2 (2.5 μM)抑制 Aβ40 聚集。

DASA分子开关的研究还处于起步阶段。作者的工作表明，蛋白质或肽可以减缓 DASA 的分子转换。尽管 Aβ40改变 DASA 转换行为的能力适中，但作者揭示了蛋白质如何调控转换。从研究中证实，很明显，蛋白质的疏水结合微环境（和/或与氢键一起）可能是决定转换能力的主要因素，因为与开链结构（线性结构）的结合在热力学上是有利的。这一研究为生理环境中的DASA化合物的研究展现了更多的可能性。

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β-Amyloid Peptides Manipulate Switching Behaviors of Donor–Acceptor Stenhouse Adducts

Chao Zheng*, Yue Yu, Shi Kuang, Biyue Zhu, Heng Zhou, Shao-Qing Zhang, Jing Yang, Liang Shi*, and Chongzhao Ran*

Anal. Chem., 2021, 93, 9887–9896, DOI: 10.1021/acs.analchem.1c01957