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实时原位检测线粒体内质子浓度和氧气浓度的荧光纳米传感器

线粒体作为细胞的能量中心,其参与了众多重要的细胞内生理活动,例如自由基的产生、能量生产、细胞凋亡和细胞增殖等。因此,原位监测线粒体的活动对于理解细胞活动和状态具有重要意义。那么,有没有可能通过化学传感器原位实时监测线粒体的活动呢?近日,复旦大学王旭东点击查看介绍)团队以聚苯乙烯纳米材料为载体,构建了一种实时原位检测线粒体内质子浓度和氧气浓度的荧光纳米传感器。


氧化磷酸化是线粒体内发生的最重要的生化反应之一,反应生成了细胞内作为能量单元的分子——三磷酸腺苷(ATP)。在这个过程中,电子由电子给体传递给氧气分子,释放的能量可以通过电子流传递,驱动质子逆浓度梯度跨膜运输,形成pH梯度。当质子通过化学渗透回流时,释放的能量驱动ATP合成酶将ADP合成为ATP。因此,同时检测线粒体内的质子浓度和氧气浓度对于检测线粒体的活动具有重要的意义。目前,已有一些荧光纳米传感器可实时原位检测细胞内的氧气浓度或者质子浓度,但是可同时检测氧气浓度和质子浓度的传感器依然十分匮乏。这主要是因为将多个不同性质的染料分子以及靶向单元集成在同一单位载体上具有较大的难度,需要兼顾染料的物化性质和光谱性质等。


复旦大学团队开发的质子浓度和氧气浓度双参数荧光纳米传感器提供了一个很好的解决方案。聚苯乙烯作为常见的聚合物材料,合成方法成熟,稳定性好,但由于其表面化学惰性,限制了其在一些领域的应用,尤其是在生物领域。他们通过将苯乙烯和甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐(AEMH)共聚,得到了表面带有活性氨基基团的聚苯乙烯纳米颗粒,并且通过调整原料比例,合成了尺寸在50 nm左右的单分散纳米颗粒。氧气敏感探针PtOEP和参比探针RBITC在聚合过程中被包埋在聚苯乙烯纳米颗粒内部,从而减少了周围溶液环境对氧气检测的干扰。pH敏感探针FITC和线粒体靶向分子TPP通过与纳米颗粒表面氨基反应,共价连接在颗粒表面,提高了FITC与溶液中质子的接触程度,增加了质子浓度检测的准确性,同时更好地实现了靶向功能。该双参数荧光传感器能灵敏地检测pH值(4.5~10.0)和氧气浓度,并且具有优异的可逆性。同时,其具有十分低的生物毒性和显著的线粒体靶向效果,从而被运用于检测HeLa细胞中线粒体内pH值和氧气浓度的检测。

图1. 氧气和pH双参数荧光纳米传感器示意图。图片来源:Anal. Chem.


该传感器优异的性能使其可应用于检测线粒体在药物CCCP刺激下的pH值和氧气浓度变化。在CCCP刺激下前10分钟,他们观测到pH值和氧气浓度有明显的下降,这是因为CCCP作为解偶联剂使大量质子回流,促使了氧气被消耗。在第20分钟到30分钟,他们观测到质子浓度基本保持稳定,而氧气浓度有所回升,可能是由于空气中的氧气重新溶解所致。鉴于其简单便捷的制备方法和优异的性能,该传感器可以灵敏地检测线粒体中氧浓度和质子浓度的变化,使其成为研究线粒体功能的有用工具之一。简单的纳米结构为设计多参数纳米传感器提供了一种思路。

图2. 传感器用于检测HeLa细胞线粒体在CCCP刺激下的氧气浓度和质子浓度变化情况。图片来源:Anal. Chem.


这一成果近期发表在Analytical Chemistry 上,文章的第一作者是复旦大学博士研究生连莹


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Active-Targeting Polymeric Dual Nanosensor for Ratiometrically Measuring Proton and Oxygen Concentrations in Mitochondria

Ying Lian, Zhenzhen Lin, Zeyu Zhang, and Xu-dong Wang*

Anal. Chem.202193, 8291–8299, DOI: 10.1021/acs.analchem.1c01156


王旭东教授课题组简介


王旭东,复旦大学人类表型组研究院研究员,博士生导师,上海市高校“东方学者”特聘教授,Europtrode组织永久执委会委员。王旭东教授课题组的研究领域为先进光学传感与应用,通过建立光学传感新方法、新材料、新模式、新技术、新应用和新设备,实现原位、现场、在线的连续定量测量和跟踪。目前已在Chem. Soc. Rev.,J. Am. Chem. Soc.,Angew. Chem. Int. Ed.,Anal. Chem.等国际权威期刊发表论文50篇,论文总引用次数超过3900次,H-Index为26。课题组的基础科学研究与实际应用紧密结合,成功实现研究成果向实际生产力的重要转化,其中获得6项国家授权发明专利,更有多项成果已被德国航空航天中心DLR和世界最大的光学传感器生产企业PreSens公司运用并实现产业化成功推向市场。


王旭东

https://www.x-mol.com/university/faculty/62693 

课题组链接

www.wangslab.com 


科研思路分析


Q:这项研究最初是什么目的?或者说想法是怎么产生的?

A:如上所述,我们的研究兴趣是探究线粒体的活动情况。众所周知,线粒体作为细胞的“能量中心”,其是否处于正常工作状态对于细胞内的生理活动十分重要。那么,我们就想到通过检测线粒体内一些分子的浓度来实现对线粒体状态的监控。我们选择了荧光成像技术,因为其具有能实时原位检测、对样品损伤小、速度快、灵敏度高等优点。对于已有的一些研究成果,通常只能检测线粒体内的一个参数,但是生理活动十分复杂,往往涉及到多个分子,因此我们就想说构建多参数荧光纳米传感器,探究多个参数之间的关联性。



Q:研究过程中遇到哪些挑战?

A:本项研究中最大的挑战是如何构建多参数纳米荧光传感器,寻找合适的染料分子,合适的载体,以及合适的合成和修饰方法。在这个过程中,我们团队在荧光染料和纳米材料构建方面的经验积累起了至关重要的作用。常用的氧气敏感探针具有一定的疏水性,而pH敏感探针具有亲水性,将不同物化性质的染料分子集合在一个载体上需要巧妙的构思。此外加上参比探针,共有三个荧光分子,避免光谱的重叠也是一个需要考虑的问题。


Q:该研究成果可能有哪些重要的应用?哪些领域的企业或研究机构可能从该成果中获得帮助?

A:该双参数荧光纳米传感器在HeLa细胞线粒体中的氧气浓度和质子浓度检测上表现优异,且能够实现实时成像,呈现结果较为直观。其有助于人们进一步理解线粒体的生理活动、监测线粒体的状态。我们相信这项研究成果为构建多参数荧光纳米传感器提供了一种可行的思路。


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