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PANDA:利用脱氧核酶及肽核酸构建的新型基因工程工具

在生物学中,大多数酶的化学本质为蛋白质,而一小部分酶的化学本质是RNA,称为核酶(ribozyme)。脱氧核酶(DNAzyme,又称deoxyribozyme或catalytic DNA)则是一类化学本质为短链DNA的酶。其特殊的DNA序列使其可以在三维空间内折叠为具有催化活性的结构,并催化一系列生物化学反应。与蛋白质或RNA构成的酶相比,脱氧核酶受益于其DNA化学结构,具有更高的稳定性,也更易于体外合成与扩增。同时,脱氧核酶仍可拥有和其他天然酶一样甚至更好的催化活性和特异性。因此,脱氧核酶在生物成像、检测和传感等生物化学领域有着重要的应用。


脱氧核酶本身由DNA构成,而其底物也可以是DNA。一些特定的脱氧核酶可以催化底物DNA在特定位置的磷酸二酯键水解,其催化水解产物的末端(3’-OH与5’-PO43-)与其他在基因工程中广泛应用的工具酶(例如限制酶及Cas9)产生的末端完全相同。然而,脱氧核酶在基因工程领域的应用却鲜有报道。其主要原因是脱氧核酶在结合DNA底物的过程中需要与底物形成碱基互补配对,而基因工程中目标底物DNA则多为双链DNA(double-stranded DNA)。在双链DNA中,所有碱基均已与其互补链碱基配对,因而脱氧核酶很难结合双链DNA并催化其水解。


近日,伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校陆艺点击查看介绍)团队克服了这一困难,并报道了首个利用脱氧核酶完成双链DNA切割的基因工程工具:PANDA(PNA-assisted double-stranded DNA nicking by DNAzymes)。陆艺团队在PANDA系统中引入了肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)。由于肽核酸可以特异性地入侵双链DNA,解开其中的一小部分已配对双链并将其以单链DNA的形式暴露出来,脱氧核酶得以结合该单链区域并催化特定磷酸二酯键的水解。通过不同肽核酸和脱氧核酶的组合,该团队在质粒双链DNA上使用PANDA完成了高效、特异的单链切口(nick)或双链断裂(double-strand break,DSB)。值得注意的是,由于在PANDA系统中使用的脱氧核酶和肽核酸均具有序列特异性,PANDA整体对靶标序列的特异性在多数情况下可以达到单碱基级别。同时,由于肽核酸和脱氧核酶的分子量均远小于大多数蛋白质,PANDA有较大潜力在空间受限的环境中仍保持高活性。

图1. 基因工程工具CRISPR/Cas9(A)及PANDA(B)。图片来源:J. Am. Chem. Soc.


该团队在文章中证明了通过更改肽核酸与脱氧核酶结合臂(binding arm)的序列,PANDA的靶标序列可以被自定义。此外,作为概念验证,陆艺团队成功地将PANDA应用于重组DNA的构建。团队使用PANDA系统完全取代了限制酶对质粒进行切割,并在T4连接酶的帮助下在质粒上引入了一个外源DNA片段。由此证明了PANDA在基因工程领域的广大应用前景。

图2. PANDA系统应用于构建重组DNA。图片来源:J. Am. Chem. Soc.


陆艺团队表示,PANDA是首个将脱氧核酶应用于基因工程中切割双链DNA的示例。基于脱氧核酶及肽核酸的上述优点,PANDA可以在未来继续发展成为更强有力的基因工程工具。特别地,团队将致力于使用PANDA在细胞中完成高效、低脱靶效应的基因编辑,使其成为继ZFN、TALEN及CRISPR/Cas之后又一基因编辑工具。


该工作近期已于Journal of the American Chemical Society 在线发表。论文的通讯作者为伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校化学系教授陆艺,第一作者为伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校化学系博士研究生吕明宽


原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面。或点此查看原文):

PNA-Assisted DNAzymes to Cleave Double-Stranded DNA for Genetic Engineering with High Sequence Fidelity

Mingkuan Lyu, Linggen Kong, Zhenglin Yang, Yuting Wu, Claire E. McGhee, and Yi Lu

J. Am. Chem. Soc., 2021143, 9724–9728, DOI: 10.1021/jacs.1c03129


导师介绍

陆艺

https://www.x-mol.com/university/faculty/188 


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