PANDA：利用脱氧核酶及肽核酸构建的新型基因工程工具

在生物学中，大多数酶的化学本质为蛋白质，而一小部分酶的化学本质是RNA，称为核酶（ribozyme）。脱氧核酶（DNAzyme，又称deoxyribozyme或catalytic DNA）则是一类化学本质为短链DNA的酶。其特殊的DNA序列使其可以在三维空间内折叠为具有催化活性的结构，并催化一系列生物化学反应。与蛋白质或RNA构成的酶相比，脱氧核酶受益于其DNA化学结构，具有更高的稳定性，也更易于体外合成与扩增。同时，脱氧核酶仍可拥有和其他天然酶一样甚至更好的催化活性和特异性。因此，脱氧核酶在生物成像、检测和传感等生物化学领域有着重要的应用。

脱氧核酶本身由DNA构成，而其底物也可以是DNA。一些特定的脱氧核酶可以催化底物DNA在特定位置的磷酸二酯键水解，其催化水解产物的末端（3’-OH与5’-PO₄^3-）与其他在基因工程中广泛应用的工具酶（例如限制酶及Cas9）产生的末端完全相同。然而，脱氧核酶在基因工程领域的应用却鲜有报道。其主要原因是脱氧核酶在结合DNA底物的过程中需要与底物形成碱基互补配对，而基因工程中目标底物DNA则多为双链DNA（double-stranded DNA）。在双链DNA中，所有碱基均已与其互补链碱基配对，因而脱氧核酶很难结合双链DNA并催化其水解。

近日，伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的陆艺（点击查看介绍）团队克服了这一困难，并报道了首个利用脱氧核酶完成双链DNA切割的基因工程工具：PANDA（PNA-assisted double-stranded DNA nicking by DNAzymes）。陆艺团队在PANDA系统中引入了肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）。由于肽核酸可以特异性地入侵双链DNA，解开其中的一小部分已配对双链并将其以单链DNA的形式暴露出来，脱氧核酶得以结合该单链区域并催化特定磷酸二酯键的水解。通过不同肽核酸和脱氧核酶的组合，该团队在质粒双链DNA上使用PANDA完成了高效、特异的单链切口（nick）或双链断裂（double-strand break，DSB）。值得注意的是，由于在PANDA系统中使用的脱氧核酶和肽核酸均具有序列特异性，PANDA整体对靶标序列的特异性在多数情况下可以达到单碱基级别。同时，由于肽核酸和脱氧核酶的分子量均远小于大多数蛋白质，PANDA有较大潜力在空间受限的环境中仍保持高活性。

图1. 基因工程工具CRISPR/Cas9（A）及PANDA（B）。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

该团队在文章中证明了通过更改肽核酸与脱氧核酶结合臂（binding arm）的序列，PANDA的靶标序列可以被自定义。此外，作为概念验证，陆艺团队成功地将PANDA应用于重组DNA的构建。团队使用PANDA系统完全取代了限制酶对质粒进行切割，并在T4连接酶的帮助下在质粒上引入了一个外源DNA片段。由此证明了PANDA在基因工程领域的广大应用前景。

图2. PANDA系统应用于构建重组DNA。图片来源：J. Am. Chem. Soc.

陆艺团队表示，PANDA是首个将脱氧核酶应用于基因工程中切割双链DNA的示例。基于脱氧核酶及肽核酸的上述优点，PANDA可以在未来继续发展成为更强有力的基因工程工具。特别地，团队将致力于使用PANDA在细胞中完成高效、低脱靶效应的基因编辑，使其成为继ZFN、TALEN及CRISPR/Cas之后又一基因编辑工具。

该工作近期已于Journal of the American Chemical Society 在线发表。论文的通讯作者为伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校化学系教授陆艺，第一作者为伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校化学系博士研究生吕明宽。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面。或点此查看原文）：

PNA-Assisted DNAzymes to Cleave Double-Stranded DNA for Genetic Engineering with High Sequence Fidelity

Mingkuan Lyu, Linggen Kong, Zhenglin Yang, Yuting Wu, Claire E. McGhee, and Yi Lu

J. Am. Chem. Soc., 2021, 143, 9724–9728, DOI: 10.1021/jacs.1c03129

导师介绍

陆艺

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