活细胞膜上的深度学习辅助单分子示踪

膜蛋白占据了人类基因组中所编码蛋白的三分之一。它们其中大多数蛋白以多聚复合物的形式存在，并介导各种细胞功能，比如信号传导、免疫反应等。例如，最大的膜蛋白家族G蛋白偶联受体（GPCRs），占据了目前市场上所有治疗药物的50%。最近的研究表明，GPCRs信号传导与受体蛋白复合物的形成相关。该复合物的形成被广泛认为是将细胞外信号传递到细胞内并调控下游信号通路的第一步。然而，到目前为止，由于在实时跟踪这技术的限制，受体蛋白在配体刺激下的初期信号传导仍存在争议。单分子荧光示踪技术因其可实现对目标蛋白分子定位与分布的追踪，被公认为当前研究蛋白功能的强有力工具。但由于蛋白在细胞膜上的不均匀分布及其蛋白间的相互作用，对蛋白动态分子的准确、快速识别仍然具有挑战性。

近期，中国石油大学（华东）蛋白质分子工程实验室黄方（点击查看介绍）和何化（点击查看介绍）课题组开发了一种深度学习辅助单分子荧光成像技术，可应用于研究活细胞膜上CXCR4受体蛋白的聚集。相关成果发表在国际化学权威杂志Analytical Chemistry 上。中国石油大学（华东）博士生王倩为论文第一作者，何化副教授和黄方教授为该论文的共同通讯作者。

在本工作中，研究者利用稳定性好、亮度高及几乎不闪烁的量子点免疫标记了活细胞膜上的CXCR4受体蛋白（图1a），构建了一个由卷积层、最大池化层和全连接层组成的深度学习模型（图1b），使用了训练-验证-测试的方法对所搭建的模型进行了训练、评估。结果表明，该模型准确率高达98%以上（图1c）。

图1. (a) 细胞膜上CXCR4受体的量子点标记示意图，(b) 识别受体单体与复合物的深度学习模型构架示意图及（c）模型的损失和准确率曲线。图片来源：Anal. Chem.

为了证实该模型的应用潜力，并证明它可以提供受体蛋白至关重要的信息，研究者使用这种深度学习辅助的单分子荧光成像方法来快速、准确地识别、跟踪细胞膜上的CXCR4受体分子（图2a）。图2b和2c显示了细胞膜上单个CXCR4的两个典型轨迹，即处于静止不动状态和运动状态的。由图2d可知，静止不动的受体分子占总分子的百分比。当SDF-1α配体刺激后，静止不动的受体蛋白的百分比增加，运动的减少，受体的扩散系数减小，且单体分子数量降低，证实了配体诱导活细胞膜上CXCR4聚合的推测。

图2. 深度学习辅助单分子荧光追踪活细胞膜上表达12 h的CXC4受体，（a）细胞膜上量子点标记的CXCR4受体单分子荧光成像图片，（b-c）静止和运动的受体扩散轨迹，（d）不同运动状态的均方位移与时间关系曲线，（e）静止的受体比例，（f）运动的受体扩散系数，(g-h)单体与受体复合物的比例。图片来源：Anal. Chem.

为了进一步验证配体诱导的CXCR4受体相互作用，研究者对其过程进行了实时跟踪，实时观察到了CXCR4分子自由扩散并发生碰撞的过程（图3a），证实了受体单体和复合物之间存在的动态平衡过程。通过分析两个受体分子之间的结合时间来确定受体复合物的寿命（图3b-g）。经对比不同表达量下，配体刺激前、后寿命的差异，表明配体刺激促使单体与复合物之间的动态平衡向形成复合物的方向转变。

图3. 两个CXCR4受体的实时追踪和分析，(a)受体复合物形成的图像序列， 不同表达时间的受体复合物寿命分布图，(b-e) 12 h，（c-f）24 h，（c-f）48 h图片来源：Anal. Chem.

图4. 配体诱导CXCR4内化， (a)受体复合物的形成和内化示意图，(b) 细胞膜上CXCR4的数量随时间变化（c）不同处理后CXCR4受体的扩散系数。图片来源：Anal. Chem.

很多文献报道，GPCR在配体刺激之后会发生内化，为此，利用新建的方法进行了系统研究，证实了配体刺激后，CXCR4内化是通过网格蛋白介导的內吞途经内化（图4），且CXCR4受体复合物内化进入细胞内部的速率比单体高2.5倍。

该研究不仅开发了一种很具有创新性的深度学习辅助单分子荧光成像方法，而且是第一个系统研究单分子水平上观察活细胞膜上CXCR4受体蛋白在配体刺激初期的信号传导过程的例子。该方法将被广泛应用于更多的蛋白质家族聚集及信号传导的研究，以阐明它们的生理和病理功能。

该研究工作得到国家自然科学基金（21874154，42061134020）、中央高校基本科研业务费（18CX02126A）及青岛市海关研究项目（QK202035）的资助。感谢清华大学医学院夏铁老师的指导帮助。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Deep-Learning-Assisted Single-Molecule Tracking on a Live Cell Membrane

Qian Wang, Hua He*, Qian Zhang, Zhenzhen Feng, Jiqiang Li, Xiaoliang Chen, Lihua Liu, Xiaojuan Wang, Baosheng Ge, Daoyong Yu, Hao Ren, and Fang Huang*

Anal. Chem., 2021, 93, 8810–8816, DOI: 10.1021/acs.analchem.1c00547

导师介绍

黄方

https://www.x-mol.com/university/faculty/15076 

何化

https://www.x-mol.com/university/faculty/15085