Journal of American Chemical Society, 2021, DOI: 10.1021/jacs.1c03013

第一作者：黄智勇（湖南大学MBL实验室2018级硕士研究生）

通讯作者：谭蔚泓教授、王雪强教授（湖南大学）

一、引言

核酸适体是通过指数富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, SELEX)在体外筛选得到的可以特异性结合靶标分子的寡核苷酸序列。核酸适体的高特异性、高亲和力、易细胞内化和良好的组织渗透能力等优势，使其在肿瘤诊断和治疗领域有较大的应用潜力。其中，通过多样化的连接子（Linker）将核酸适体与药物分子偶联而构建的核酸适体偶联药物(Aptamer-Drug Conjugates, ApDCs)既可以将药物分子靶向递送到癌细胞，增强化疗效果，又可以降低药物分子系统毒副作用。这些优势使核酸适体偶联药物在近年来得到快速地发展，并有望成为癌症治疗中最有吸引力的靶向药物之一。然而，目前关于连接子在核酸适体偶联药物的抗癌过程中发挥的作用的研究很少有文献报道，尤其是通过自动化、模块化合成的核酸适体偶联药物，目前还没有研究过。基于连接子化学的系列研究具有以下两点重要意义：第一，有利于系统地理解核酸适体偶联药物，特别是自动化、模块化合成的核酸适体偶联药物的药物释放机制；第二，有利于开发出基于连接子化学的更高效地靶向治疗药物。

二、设计原理

为了系统地探究连接子对核酸适体偶联药物的药物释放以及抗癌效果的影响，研究人员分别以固相合成、液相偶联策略为基础构建以下三种具有不同连接子的核酸适体偶联药物：含有磷酸二酯键的核酸适体偶联药物（Con-1，Linker1）、含有二硫键连接子的核酸适体偶联药物（Con-2，Linker2）和含有氨基甲酸酯键连接子的核酸适体偶联药物（Con-3，Linker3），并以此为靶向药物递送模型来探究不同连接子的核酸适体偶联药物对药物释放和细胞毒性等方面的影响。通过关于不同合成方法和连接方式构建地含有不同连接子的核酸适体偶联药物的系列研究将有助于更好地理解核酸适体偶联药物的药物释放机制，同时也有利于开发出更高效的靶向治疗策略。

图1 通过固相合成技术和共价偶联策略构建Con-1、Con-2和Con-3

(一)、核酸适体偶联药物的药物释放机制研究

1. Con-1、Con-2和Con-3的合成与表征

研究人员根据设计方案分别以固相合成、液相偶联方法为基础构建了含有磷酸二酯键、二硫键和氨基甲酸酯连接子的核酸适体偶联药物Con-1、Con-2和Con-3，并且通过质谱证明了Con-1、Con-2和Con-3合成成功。（图2, Part I.）

2. PDE 1介导Con-1、Con-2和Con-3的药物释放研究

磷酸二酯酶 (PDE 1)是一种水解酶，能够从寡核苷酸的3’端开始水解产生5’-磷酸核苷酸。为了研究PDE 1介导的药物释放机制，研究人员通过核酸适体偶联药物响应PDE 1的药物释放实验，测试了Con-1、Con-2和Con-3的药物释放量。结果表明，Con-1几乎完全被PDE 1降解，并且释放出大量CA4。相比之下，Con-2和Con-3只有很少量CA4释放出来（图2, Part II.）。这些结果表明连接子化学对核酸适体药物偶联物的药物释放具有重要的影响，通过固相合成技术构建地含有磷酸二酯键连接子Con-1的药物释放量最大，这也为药物发挥最高效的细胞毒性提供了基础。

图2 Con-1、Con-2和Con-3的药物释放机制的研究

3. GSH介导Con-1、Con-2和Con-3的药物释放机制研究

还原性谷胱甘肽(GSH)是一种重要的维持正常细胞氧化还原稳态的内源性生物还原剂，但肿瘤细胞内高表达的GSH，增强癌细胞对化疗药物的抗性，从而降低肿瘤的治疗效果。利用癌细胞内高表达的GSH，前人已经设计出多种含有二硫键的抗体-药物偶联物和核酸适体-药物偶联物来调控抗癌药物在癌细胞内释放。基于此，为了研究GSH介导的药物释放机制，研究人员将Con-1、Con-2和Con-3与GSH共孵育，测试了Con-1、Con-2和Con-3对GSH的响应情况。结果表明，随着孵育时间的延长（4 h、12 h到24 h），Con-2被渐渐分解。相比之下，Con-3对GSH没有响应，即使孵育了24 h仍然没有显著变化。出乎意料的是，Con-1与GSH孵育4 h、12 h和24 h时，Con-1也会渐渐被分解（图2, Part III.），说明了Con-1与GSH发生了相互作用，并且这种作用可能与GSH的亲核作用有关。Con-1能够同时被GSH亲核进攻和磷酸二酯酶降解释放药物，这为药物发挥最高效的细胞毒性提供了更加坚实的基础。

4. GSH介导核酸适体偶联药物降解的通用性研究

GSH对自动化、模块化合成的ApDC响应，并使其降解是一个出乎意料的发现。为了验证这种现象的通用性，研究人员进一步设计了含有磷酸二酯键的6T-CA4、XQ-2d-CA4和TCO1-CA4开展了同样的实验。结果表明，6T-(PO4)-CA4与GSH孵育24 h，6T-(PO4)-CA4被完全分解为两个片段。同样地，XQ-2d-(PO4)-CA4或者TCO1-(PO4)-CA4与GSH孵育24 h，两者均被GSH降解成了几个片段（图2, Part IV）。基于这些结果，研究人员得出结论，GSH能够触发ApDC降解释放药物，有望对ApDC的抗癌效果产生深远影响，并为设计靶向癌症疗法提供新的方案。

(二)、细胞特异性、内化能力和细胞毒性考察

1. 细胞特异性、内化能力考察

为了考察药物末端修饰对于细胞特异性的影响，研究人员将Sgc8c、Con-1、Con-2、Con-3和Lib-CA4分别与结直肠癌细胞（HCT116）、人胚肾细胞（HEK293）共孵育。研究发现，Con-1、Con-2、Con-3的荧光位移水平与Sgc8c基本一致，表明CA4末端修饰没有对Sgc8c的特异性识别功能造成影响；相比之下，Sgc8c和三种偶联物均不能与人胚胎肾细胞(HEK293)特异性结合，表明了Con-1、Con-2、Con-3具有优异的特异性（图3a和b）。研究人员使用Sgc8c、Con-1、Con-2、Con-3和Lib-CA4与HCT116细胞共孵育进一步考察为药物末端修饰对于细胞内化能力的影响。结果表明，三种偶联物与Sgc8c一样，均能有效地进入HCT116细胞。相比之下，Lib-CA4却没有表现出任何的内吞作用（图3c），表明Con-1、Con-2和Con-3保持了良好的细胞内化能力。这些结果为药物能够靶向递送到癌细胞发挥药效提供了保证。

图3 细胞特异性结合、内化能力和细胞毒性测试

2. 靶细胞毒性探究

为了考察上述药物释放机制对ApDC的抗癌功效产生影响，研究人员进行了细胞毒性测试。研究人员设计了一种孵育-洗涤-孵育策略，将Con-1、Con-2和Con-3与HCT116细胞分别孵育6 h，用PBS洗涤3次，然后继续在37 ℃下孵育 18、42和66 h，最后在不同时间点测量细胞活力，结果如图3 d 所示。研究表明，在所有时间点中，Con-1均表现出最强的抑制细胞生长能力，Con-2的细胞毒性小于Con-1，Con-3 基本上不具有抑制细胞生长能力。这些结果表明，由于Con-1对磷酸二酯酶和GSH均能响应（图2），使Con-1比Con-2、Con-3更容易释放药物，从而产生更高效的细胞毒性。最后，为了更好理解磷酸二酯键连接子偶联物的独特响应途径引起地抗癌效果的提高，研究人员进一步设计了XQ-2d-(PO4)-CA4和XQ-2d-(S-S)-CA4，测试了它们对靶细胞的细胞毒性，结果如图3e所示，XQ-2d-(PO4)-CA4比XQ-2d-(S-S)-CA4有更大的细胞毒性（0.4~3.70 nM），能够更有效地诱导胰腺癌细胞(K562)凋亡。通过上述实验结果，研究人员证明了药物释放机制是Con-1比Con-2 和 Con-3 展现更高效细胞毒性的关键因素，同时为探索药物释放机制对细胞毒性影响的通用性奠定了基础。

四、总结与展望

为了探究连接子对核酸适体偶联药物的药物释放和抗癌功效的影响，研究人员设计合成了三种包含磷酸二酯键、二硫键或氨基甲酸酯连接子的Sgc8c-CA4偶联物进行了系列研究。研究发现，自动化、模块化合成的Con-1不仅对磷酸二酯酶有响应，而且对还原性GSH有响应。这种独特的响应途径也使Con-1比Con-2和Con-3具有更高效地诱导癌细胞凋亡的能力。此外，研究人员还发现这种独特的响应途径同样适用于XQ-2d-CA4，这表明磷酸二酯酶和GSH共同介导的自动化、模块化合成的ApDC的药物释放具有通用性。因此，通过上述系列药物释放机制以及药物抗癌效果的系统研究，将有利于设计、开发出更高效地癌症靶向药物。