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Zip-RPA用于甲状腺FNA样本低丰度BRAF V600E突变的快速高灵敏检测

注:文末有研究团队简介及本文科研思路分析


甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤之一,近年来的发病率增长迅速,在我国约以每年20%的速度持续增长。当前甲状腺癌的诊断的主要方式的通过超声下甲状腺细针穿刺活检(FNA)样本细胞病理检查。但是,FNA细胞病理仍有10-20%的样本不能确定性诊断。因此需要结合分子诊断结果进行辅助诊断来弥补细胞病理的不足。BRAF V600E突变作为甲状腺乳头状癌最常见的突变之一,已成为实验室中甲状腺癌诊断的常规分子诊断项目。然而,实验室BRAF V600E突变的常规分子诊断方法ARMS-PCR和二代测序很难同时满足灵敏、快速、低成本的要求。尤其是对于突变含量极低的细针穿刺样本(MAF 0.1%-1%),需要提高二代测序的深度来保证灵敏度,这就延长了检测时间,提高了检测价格,同时FNA样本难以满足二代测序的要求。


为了弥补现有方法的不足,重庆医科大学附属第一医院程伟教授(点击查看介绍)团队结合拉链核酸(ZNA)特异的突变识别能力和重组酶聚合酶扩增(RPA)等温快速扩增性能,提出了名为Zip-RPA的新方法用于检测FNA样本中的低丰度BRAF V600E突变。RPA技术是类PCR反应的等温扩增技术,在重组酶的作用下,扩增引物能够在室温条件下嵌入靶目的双链中进行扩增,较PCR技术速度更快,条件更简单,灵敏度更高。而ZNA是修饰了精胺基团的特殊核酸,具有比普通核酸更强的结合力,与之相对的,错配碱基对链杂交稳定性的破坏也显著大于普通核酸。所以我们将两者结合起来,利用ZNA对突变碱基进行甄别,而后诱发针对突变等位基因的RPA高效扩增(如图1)。

图1. Zip-RPA检测BRAF V600E突变原理


在Zip-RPA体系中,ZNA在重组酶的作用下嵌入靶基因并覆盖突变甄别区域,ZNA探针与完全互补配对的野生型等位基因稳定结合;与单碱基错配的突变型等位基因形成不稳定结合。随后,具有强链置换活性的Phi 29DNA聚合酶能将与突变型等位基因结合的ZNA探针解离进而诱发RPA反应;而ZNA探针与野生型等位基因极其稳固,无法经Phi 29聚合酶的强链置换活性解离,阻止RPA反应;由此实现突变的甄别。经ZNA的特异甄别和RPA的高效扩增,Zip-RPA可在40分钟内即可检测低至0.1%丰度的突变基因组DNA(如图2)。

图2. 通过检测不同突变含量的基因组DNA探索Zip-RPA的灵敏度。


图3. 分别采用ARMS PCR(图A)和Zip-RPA(图B)技术对BRAF V600E突变阳性和阴性临床样本进行检测。


将Zip-RPA应用于49例临床甲状腺FNA样本的BRAF V600E突变检测,检测结果与临床常规ARMS-PCR结果完全一致,且检测时间缩短一半(如图3)。结合临床术后病理诊断结果,新方法达到了96.3%的诊断灵敏度和100%的特异性。因此,基于Zip-RPA的分子诊断新方法能够快速高灵敏甄别临床FNA样本中的单碱基基因突变,在临床甲状腺癌的快速高灵敏诊断方面具有很好的临床应用前景。


这一成果近期发表在Analytical Chemistry 上,文章的第一作者是重庆医科大学附属第一医院硕士研究生张路倓(现就职于厦门大学附属妇女儿童医院)和博士后彭键、陈君曼。通讯作者是重庆医科大学附属第一医院的程伟教授和厦门大学附属妇女儿童医院葛运生教授。


原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):

Highly Sensitive Detection of Low-Abundance BRAF V600E Mutation in Fine-Needle Aspiration Samples by Zip Recombinase Polymerase Amplification

Lutan Zhang, Jian Peng, Junman Chen, Lulu Xu, Yangli Zhang, Ying Li, Jie Zhao, Linguo Xiang, Yunsheng Ge, Wei Cheng

Anal. Chem., 202193, 5621–5628, DOI: 10.1021/acs.analchem.1c00405


科研思路分析


Q:这项研究最初是什么目的?或者说想法是怎么产生的?

A:如上所述,当前的最新的突变检测技术(如NGS和数字PCR)都是往更先进的平台,更高的灵敏度、特异性及绝对定量的方向发展,而这些技术往往需要配备大型精密的设备,严格的实验条件,和长时间的人员培训来运作,我们可以谓之为“高精尖”。但是,我们发现这与当前床旁诊断(POCT)的理念有一定冲突,上述技术无法做到小型化且在普通的环境下进行,而且在检测速度方面,也存在一定限制。另外,NGS和数字PCR由于实验成本上的限制,具有样本数量的要求,所以也难以实现私人订制型的个体化分子诊断。基于以上背景,我们产生了一个想法,能不能建立一个快速,低成本,操作简单,结果方便读取且又满足临床灵敏度需求的,可以谓之为“小快灵”的突变检测方法,应用于POCT和个体化医疗。基于以上需求,我们将目光投向了非常具有POCT潜力的RPA技术,RPA技术拥有极快的扩增速度且仅需简单的实验条件。但是RPA技术由于原理上的限制,导致该技术在突变检测领域的特异性不佳。所以我们结合RPA原理,尝试利用特殊核酸(ZNA)的添加来提高RPA进行单碱基甄别的特异性。最后我们发现,ZNA可以在RPA体系中发挥作用,而经优化后的Zip-RPA技术具备了速度、灵敏度和特异性的综合优势。


Q:研究过程中遇到哪些挑战?

A:研究中遇到的最大挑战主要是我们实验发现,ZNA探针能够融入RPA体系中封闭靶突变区域,但是由于ZNA结合过于稳固,即使存在错配碱基,RPA试剂的原始用酶(聚合酶)也无法动摇其稳定性。本课题组在等温扩增领域有不错的研究基础,拥有许多等温扩增用酶的使用经验。所以我们尝试性地向RPA体系中添加了具有强链置换活性Phi 29聚合酶。结果惊喜的发现,Phi 29聚合酶不仅能在RPA体系内保持活性,而且能够发挥出强链置换的活性并恰好能够满足ZNA甄别单碱基突变的需求,达到有单个错配碱基即可解离不再封闭扩增,而完全互补则保持稳定结合阻滞扩增。


Q:该研究成果可能有哪些重要的应用?哪些领域的企业或者研究机构可能从该成果中获得帮助?

A:新方法适用于单碱基肿瘤相关突变的快检,结果快速反馈临床,方便临床的诊疗。其次,由于实验仪器并不严格,该方法除荧光信号输出方式之外,亦可通过试纸显带的方式进行结果的输出,可以满足广大基层医院的实验条件与需求。同时,该方法也具有高通量的潜力,既往研究中,已有不少RPA技术与微流控技术相结合的工作。因此,只需将Zip-RPA与微流控技术相结合,可实现多样本多通道同步检测的肿瘤/遗传相关突变筛查需求。


导师介绍


程伟,重庆医科大学附属第一医院临床分子医学检测中心副主任,医学博士,研究员,博士生导师。重庆英才-创新领军人才,重庆市杰青,重庆市中青年医学高端人才。重庆市高校创新研究群体负责人(体外诊断新技术及转化)。2020年重庆市援疆检验医疗队领队。


主要从事临床分子诊断技术新原理、新方法的研发及临床应用研究。目前在Angew. Chem., Theranostics, Anal. Chem., Biosens. Bioelectron.等期刊发表SCI论文80余篇。先后主持国家自然科学基金项目3项,省部级项目4项。获2017年获重庆市自然科学一等奖。


https://www.x-mol.com/university/faculty/125180 


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