滑铁卢大学刘珏文教授课题组近年来重要工作概览

刘珏文，加拿大滑铁卢大学化学系教授，博士生导师，University Research Chair。2000年于中国科技大学化学系获得本科学位。2005年于美国伊利诺伊大学（UIUC）获得化学博士学位。之后在美国新墨西哥大学和Sandia国家实验室从事博士后研究工作，自2009年起就职于滑铁卢大学。获得加拿大化学会Fred Beamish奖和McBryde奖章，并于2019年入选加拿大皇家学会（青年学院）。近年来在Chem. Rev.、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、Anal. Chem.等期刊上发表研究论文共计400余篇，文章总引用数达27000余次，H-index为79。现担任Biosensors & Bioelectronics 核酸部分编辑，Trends in Analytical Chemistry (TrAC)、《中国化学快报》、FACETS等杂志副主编，Journal of Analysis and Testing 编委，和Langmuir、Analytical Methods、Sensors, Particle and Particle Systems Characterization编委会顾问。

刘珏文教授。图片来源：滑铁卢大学

刘珏文教授课题组现主要从事核酶、核酸适配体的筛选，生物化学表征和分析化学的应用。同时也关注纳米材料和软物质的分析化学、物理化学以及表界面性质的研究。本文介绍刘教授近年来的一些代表性工作。

（一）体外筛选对金属离子有特异性的脱氧核酶

众所周知DNA作为主要的遗传物质，具有极高的稳定性、可编程性和易于修饰等特点。其磷酸骨架和碱基对不同金属离子有着不同的结合能力，因此常用来开发检测金属离子的生物传感器。刘珏文课题组通过体外筛选技术获得对不同金属离子有特异性活性的脱氧核酶（即基于DNA的催化剂），对RNA的磷酸二酯键进行切割（Chem. Rev., 2017, 117, 8272）。课题组特别针对切割位点磷酸基团和金属离子的作用进行筛选文库的设计。通过硫代磷酸酯键的修饰，获得了镉、铜等亲硫金属的脱氧核酶。最近，他们和麦吉尔大学Sleiman教授合作，合成了甘氨酰组氨酸修饰的富含氮原子的底物切割位点。在用锌离子进行筛选后，获得一系列的脱氧核酶，分别依赖一个、两个或者三个锌离子进行催化反应（Angew. Chem. Int. Ed., 2020, 59, 3573）。而且使用的锌离子越多，对锌离子的选择性就越强，对比钴离子，该类脱氧核酶的选择性最强能达到5000倍（图1）。

图1. 甘氨酰组氨酸修饰的DNA文库通过体外筛选后获取的一系列对锌离子响应的脱氧核酶。

（二）DNA在纳米材料表面的修饰

生物分子修饰的纳米材料在生物传感、药物输送、自组装以及生物催化等领域应用广泛。理解生物分子在材料表面的吸附行为对构筑有效的纳米生物材料至关重要。在各种纳米材料里，金纳米粒子由于其优异的光学、催化和表面性质，受到广泛的关注（Matter, 2019, 1, 825-847）。课题组细致地研究了DNA在纳米金表面的吸附，改进了DNA修饰的方法。例如通过冷冻，可以使巯基修饰的DNA快速地链接到金表面，达到较高的DNA密度，而且不需要加入任何其他的试剂（图２）（J. Am. Chem. Soc., 2017, 139, 9471）。其原因可以归于结冰产生的浓缩效应以及DNA在冰冻状态下的拉伸和排列（Angew. Chem. Int. Ed., 2019, 58, 2109）。

刘珏文课题组发现，不同缓冲溶液分子在金上有不同的吸附能力，其排序为HEPES > PIPES > MOPS > MES > 柠檬酸，磷酸。通过使用较强吸附能力的缓冲溶液（如HEPES），能对DNA分子的吸附产生抑制作用（Chem. Sci., 2020, 11, 6795）。与此类似，盐溶液里的阴离子也能吸附于金表面，从而影响DNA在金上的排列（J. Am. Chem. Soc., 2018, 140, 4499）和相关的分析检测（Anal. Chem., 2020, 92, 13354）。

图2. 冰冻发制备DNA修饰的纳米金。

由于生物分子的结构与功能受温度影响较大，对其吸附研究多在4-37 ℃的温度范围内进行，而高温和低温的极端条件被有意避免。课题组研究发现，相比于室温，DNA在冷冻和高温下，均可更稳定地吸附于氧化石墨烯（GO），然而DNA吸附的机理却截然相反。需指出的是，GO由含氧官能团的亲水区域以及石墨烯自身的疏水区域所组成（图3）。室温下，DNA可通过多种作用力（如氢键、π-π堆积）吸附于GO的不同区域，并且，较高的盐浓度导致DNA采取更加紧凑的构象。冷冻和室温下的主要吸附作用力均为氢键，而冷冻的拉伸效应促使DNA采取更加伸展的构象吸附在GO表面。与之相反，高温则更加有利于分子间的疏水作用。理论计算表明，278 K时，DNA通过氢键迅速地吸附于含氧较多的亲水区域，而358 K时，则通过π-π堆积吸附于石墨烯疏水区域（J. Am. Chem. Soc., 2020, 142, 34, 14702–14709）。

图3. 上图：DNA在氧化石墨烯不同区域吸附以及温度影响的示意图。左下：不同序列DNA吸附强度比较。右下：计算机模拟DNA在氧化区域（左）和石墨烯区域（右）的吸附状态。

（三）核酸适配体分析传感的机理探索

近年来，借助纳米材料及荧光标记的DNA构建的生物传感器受到广泛关注。主要思路是利用纳米材料较强的荧光猝灭性能以及材料表面对单链/非结构DNA与双链/折叠DNA吸附能力的差异，设计基于荧光强度变化的探针。纳米材料种类繁多，表面化学性质差异巨大，对于DNA的吸附能力也大不相同。例如，金表面对DNA的吸附能力比较强，而氧化石墨烯吸附DNA的能力相对弱一些（Anal. Chem., 2019, 91, 14743）。目前的研究主要集中在DNA适配体的吸附，和适配体与靶标分子的结合，而忽略了靶标分子在纳米材料上的吸附。利用纳米金聚集时的颜色变化，通过细致的对比实验，课题组发现很多小分子靶标都和纳米金表面有着很强的吸附作用，使金更容易聚集，同时抑制适配体的吸附，例如多巴胺、三聚氰胺、卡拉霉素等分子就属于此类（图4A）（Anal. Chem., 2020, 92, 9370）。而ATP吸附后使得金变得更稳定，同时抑制DNA的吸附（图4B）（ACS Sens., 2020, 5, 2885）。这些分子都不能用简单的纳米金比色法进行检测，所以用金表面表征适配体和靶标分子的结合要尤其小心。例如课题组发现文献报道的砷的适配体对砷并没有特异性结合，而其很多表征工作都是通过金表面完成的（Anal. Chem., 2019, 91, 10887）。该方法只适用于少数的靶标，例如不吸附在金表面的钾离子（图4C）。作者推荐使用不能结合靶标的突变适配体作为对照，并且对此方向进行了综述（Anal. Sens., 2021, 1, 30）。

最近，类似的研究也在金属氧化物上开展（例如二氧化铈）。研究发现，虽然在溶液中adenosine和ATP对于其适配体有着类似的结合能力，但是只有ATP能够产生较强的荧光信号，而adenosine则不产生任何的信号。适配体和氧化物吸附太强，导致适配体和靶标分子的结合不能和原有的吸附作用竞争。ATP产生的信号源于其三磷酸根对于氧化物表面的较强吸附作用。进一步实验发现GTP也能产生类似的信号，而且用非ATP适配体的其他核酸序列也能对ATP、GTP产生响应。这些结果都说明了非特异性竞争的重要性（Anal.Chem., 2021, 93, 5, 3018）。

图4. 根据适配体靶标分子和纳米金的吸附作用进行分类：（A）靶标吸附并且使金聚集；（B）靶标吸附并且使金更稳定；（C）靶标不吸附。只有（C）中的颜色变化能反映适配体和靶标分子的结合。

（四）纳米酶

纳米酶是指具有类似酶催化活性的无机纳米材料。由于比传统的蛋白酶具有更高的稳定性和更低的制备成本，近年来纳米酶材料的制备与应用引起了越来越多的关注。底物的选择性是酶的基本特征之一。然而，纳米酶材料并不具备像蛋白酶一样的底物选择性，这在一定程度上限制了纳米酶材料的进一步发展。众所周知，绝大多数的蛋白质酶类都具有特异性的底物结合位点，保证蛋白酶类高度特异性和催化活性。然而，纳米酶却不具备特异结合位点，任何扩散到其表面的底物均可反应。

刘珏文课题组通过分子印迹的方法，将纳米酶材料的底物特异性提高了近一百倍，为解决了这一问题提供了新思路。通过加入多种聚合单体和链接单体，在纳米酶-底物结合体表面引发聚合反应从而形成分子印迹的水凝胶层。待移除印迹的底物分子后，得到在纳米酶外围的底物特异性识别位点（图５）。催化反应与恒温滴定实验证实，经过印迹的纳米酶的底物特异性得到明显提升。值得注意的是，虽然用抗体或者核酸适配体修饰的纳米酶也可能会有类似的效果，但是使用这些生物分子抵消了纳米酶便宜和稳定好的优势。分子印迹材料也被称为塑料抗体，能较好的与纳米酶匹配（J. Am. Chem. Soc., 2017, 139, 5412）。

图5. 通过分子印迹提高纳米酶的底物选择性。

这一方法的普适性也得到了充分论证。多种纳米酶材料，包括具有过氧化酶或氧化酶活性的四氧化三铁、纳米金以及二氧化铈等都通过分子印迹的方法获得底物特异性的明显提升。分子印迹选择性的提高很大程度上来自于反应活性的提高。进一步研究显示印迹的高分子对底物富集、产物释放和活化能降低都有帮助（Nanoscale, 2019, 11, 4854）。就纳米酶和生物酶之间的差距和缩小这些差距的努力，该课题组最近在一篇综述文章里进行了讨论（Mater. Horiz., 2021, 8, 336）。

刘珏文教授课题组成员。图片来源：刘珏文

上面介绍了刘珏文教授课题组近年来具有代表性的一些研究方向和工作成果，其它更多具体详细的信息请参考该课题组的网站：http://www.science.uwaterloo.ca/~liujw/index.html

导师介绍

刘珏文

https://www.x-mol.com/university/faculty/75566