嵌合DNA探针辅助连接酶链式反应与电化学传感策略联用对RNA单碱基突变的超灵敏检测

RNA单碱基突变在人类疾病中扮演了重要的角色。因此，准确并敏感地检测RNA单碱基突变对一些疾病的诊断具有重要作用。然而，在临床样本中，由于痕量的RNA单碱基突变通常存在于大量野生型的RNA中，目前临床常用的RNA的检测方法如qRT-PCR等在临床样本的检测中遇到了挑战。

近期，福建医科大学林新华教授课题组与福建医科大学附属第一医院陈锦元博士等合作，构建了基于嵌合DNA探针辅助连接酶链式反应的电化学传感策略（cmDNA-eLCR），用于RNA单碱基突变的检测。该研究首先设计了一条3’端修饰两个核糖核苷酸的短链DNA探针（嵌合DNA探针，S-cmDNA），在T4 RNA连接酶2的作用下，以目标RNA为模板可将互补的cmDNA探针及正常的DNA探针连接，形成长的cmDNA探针（L-cmDNA）。接着以此L-cmDNA探针为模板，在DNA连接酶的作用下，进行连接酶链式反应（ligase chain reaction， LCR），产生大量的两端分别带巯基及生物素的双链DNA产物。最后，产生的双链DNA产物通过Au-S键固定于BSA修饰的金电极表面，当滴加SA-PolyHRPs后，HRP上的亲和素与DNA双链产物的生物素相结合，从而使HRP固定于金电极表面，并催化TMB底液产生电化学电流信号，进而对目标RNA进行定量检测（如图1所示）。

图1. 基于嵌合DNA探针辅助连接酶链式反应电化学传感技术检测RNA单碱基突变的示意图。图片来源：Anal. Chem.

该研究结合FAM荧光素标记的DNA探针和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法进行表征，结果表明只有S-cmDNA才能产生高效连接，且在连接位点的碱基上具有很高的特异性（如图2A所示）。此外，图2B结果表明第一步的反应混合物对LCR反应没有干扰且连接产生的L-cmDNA可以启动LCR，因此该方法无需额外的分离步骤。研究结果显示，构建的cmDNA-eLCR具有优异的灵敏度，在1.0×10^-15 M至1.0×10^-10M浓度之间，电流强度和目标RNA浓度的对数呈现良好的线性关系，检测限为0.6 fM（如图3）。即使在检测目标高浓度的条件下，该方法仍具有很高的特异性，可鉴别出溶液中的单碱基突变（如图4），这为其检测存在大量野生系列的复杂临床样本提供重要保证。此外，在1 ul NB4细胞RNA提取液与低浓度目标RNA共同存在情况下，该方法显示出很强的抗干扰能力，可准确的检测出溶液中痕量目标RNA，显示出该方法在已知突变的RNA为标志的相关疾病诊断中具有广阔的应用前景。

图2. （A）含有不同成分的第一步连接反应产物的15 %变性聚丙烯酰胺凝胶电泳表征图。（B）第一步反应体系对下游LCR扩增的干扰考察（3.5 %琼脂糖凝胶电泳表征）：泳道1为不含目标cDNA的LCR体系产物，泳道2为含目标cDNA的LCR体系产物，泳道3为含目标RNA的cmDNA-LCR体系产物，泳道4为添加第一步反应混合物（不包括RNA）到正常LCR体系中（含有目标cDNA）后的扩增产物。图片来源：Anal. Chem.

图3. 在最佳的实验条件下，构建的cmDNA-eLCR方法检测不同浓度RNA的i-t曲线图（A）及浓度曲线图（B）。图片来源：Anal. Chem.

图4. （A）构建的cmDNA-eLCR在检测目标高浓度的条件下（100 pM），检测完全互补的目标RNA及单碱基错配的RNA。（B）在相同实验条件下，利用传统的eLCR在高浓度下检测完全互补的cDNA及单碱基错配的cDNA。图片来源：Anal. Chem.

这一成果近期发表在Analytical Chemistry 上，文章通讯作者为福建医科大学林新华教授及福建医科大学附属第一医院陈锦元博士，第一作者是福建医科大学附属第一医院钟光贤博士。

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Ultrasensitive Detection of RNA with Single-Base Resolution by Coupling Electrochemical Sensing Strategy with Chimeric DNA Probe-Aided Ligase Chain Reaction

Guang-Xian Zhong, Chen-Liu Ye, Hong-Xiang Wei, Liang-Yong Yang, Qing-Xia Wei, Zhou-Jie Liu, Leng-Xi Fu, Xin-Hua Lin*, Jin-Yuan Chen*

Anal. Chem., 2021, 93, 911–919, DOI: 10.1021/acs.analchem.0c03563

导师介绍

林新华

https://www.x-mol.com/university/faculty/59824