体外多酶体系催化合成氨基葡萄糖

注：文末有研究团队简介 及本文科研思路分析

氨基葡萄糖（Glucosamine，GlcN，氨糖）是葡萄糖的2位羟基被氨基取代后的化合物，是一种广泛存在于有机体中的重要功能单糖。氨糖及其衍生物，在医药、食品、化妆品等方面应用十分广泛，具有广阔的市场。随着人口老龄化的加剧、运动人群的增加以及氨糖更广泛的应用的开发，全球氨糖的需求量持续上升。

目前，氨糖主要通过酸水解、酶水解甲壳素获得，存在环境污染严重、底物原料来源受限、易引起特殊体质人群过敏反应等缺陷。利用工程菌发酵葡萄糖是目前绿色安全的氨糖生产方法，但是发酵产物为乙酰氨糖，还需要额外的酶水解或酸解过程将乙酰氨糖转化为氨糖，不能通过一锅法进行氨糖生产，同时在酶水解或酸解过程中容易造成环境污染，因此，亟待开发一种低成本、低污染、环境友好的生产氨糖的新方法。

中国科学院天津工业生物技术研究所游淳研究员团队开发了一种基于体外多酶体系的氨糖合成新方法。基于体外多酶体系可操作性强、产品得率高、反应速度快的优点，他们通过五个核心酶的磷酸解—异构化—氨基化—脱磷酸作用，将淀粉和无机氨转化为氨糖（图1）。得益于脱磷酶（GlmP）催化的热力学容易发生的不可逆脱磷反应，该多酶体系理论上能够得到化学计量的淀粉到氨糖的生物转化。通过对数据库及文献检索分析，他们挖掘获得了酶活高、反应条件一致、表达量高的酶元件。通过对关键脱磷酶的仔细甄别，获得了目前报道的具有最高氨糖-6磷酸（GlcN6P）底物专一性的脱磷酶GlmP。

图1. 催化淀粉和无机氨转化为氨糖的体外多酶体系。αGP：α-葡聚糖磷酸化酶；PGM：磷酸葡萄糖变位酶；PGI：磷酸葡萄糖异构酶；GlmD：氨糖6-磷酸脱氨酶；GlmP：氨糖6-磷酸脱磷酶；G1P：葡萄糖1-磷酸；G6P：葡萄糖6-磷酸；F6P：果糖6-磷酸；GlcN6P：氨糖6-磷酸；P_i：无机磷。

将上述挖掘获得的酶元件与底物、缓冲液组成多酶催化体系进行产氨糖反应。经计算模拟分析，结果证明该体外多酶体系能够实现淀粉到氨糖的转化。之后，经过反应条件优化（初始pH值、酶添加量、镁离子浓度、铵盐浓度），在最优反应条件下，该体外多酶体系催化10 g/L淀粉生成7.2 g/L氨糖，底物摩尔转化率达到69.1%。除此之外，为了提高α-葡聚糖磷酸化酶对底物的利用率，他们向反应体系中添加了4-α-葡聚糖转移酶（4-α-glucanotransferase，4GT），将多酶体系催化淀粉到氨糖的摩尔转化率提高到75.8%。

为了测试该体外多酶体系的工业应用潜力，他们用较高浓度的底物进行了生物转化反应。实验结果显示，将淀粉浓度提高到50 g/L后，反应30小时，氨糖的浓度达到23.7 g/L，摩尔产率为47.7%（图2）。本研究新开发的氨糖生物制造系统具有制备方法简单、产品合成成本低、环境友好等特点，代表了下一代工业化氨糖生产技术，有利于促进氨糖及其相关产业的技术升级和规模扩大。

图2. 体外多酶体系催化高浓度底物合成氨糖。

这一成果近期发表在ACS Catalysis 上，文章的第一作者是中科院天津工生所孟冬冬副研究员，通讯作者为游淳研究员。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Artificial in Vitro Synthetic Enzymatic Biosystem for the One-Pot Sustainable Biomanufacturing of Glucosamine from Starch and Inorganic Ammonia

Dongdong Meng, Xinlei Wei, Xue Bai, Wei Zhou, Chun You

ACS Catal., 2020, 10, 13809-13819, DOI: 10.1021/acscatal.0c03767

游淳研究员简介

游淳，研究员，博士生导师。2010年博士毕业于复旦大学，随后在美国弗吉尼亚理工大学从事博士后研究。2016年加入中国科学院天津工业生物技术研究所任研究员、体外合成生物学中心主任。已先后在ACS Catal.、PNAS、Angewandte Chemie International Edition、Biotech. Bioeng.、Biotech. Biofuels、Appl. Environ. Microbiol.等重要学术期刊上发表40余篇SCI论文，申请20多项国内专利和2项PCT专利，并且与国内多家企业建立合作关系。目前实验室正在招收博士后或科研助理，欢迎相关专业（分子生物学，酶工程，代谢工程）的优秀人才加入团队。

游淳研究员带领的研究团队主要开展体外合成生物学的研究，围绕体外生物合成系统组装的适配性、稳定性、有效性等关键科学问题，构建超稳酶元件库，阐明人工设计途径中酶元件的结构与功能关系，创建非天然生物酶，为体外生物合成途径提供特制元件；解析酶元件和人工辅酶识别的分子机制，创制人工辅酶介导的非天然功能模块；揭示多酶复合体物质与能量流传递及分配调控机制，建立多酶复合体的人工设计原则方法；建立非细胞合成途径的工业测试与调控技术，形成人工非细胞合成体系设计与调控标准与原则，为体外生物合成体系设计与定向改造提供理论指导；实现高附加值化学品生成路线的替代，降低高值化学品生产成本。

科研思路分析

Q：这项研究最初是什么目的？或者说想法是怎么产生的？

A：氨糖是具有重要应用价值的功能糖，市场规模巨大。然而，氨糖现有甲壳素水解法或微生物发酵法存在环境污染严重、易于造成过敏反应、工业放大困难、产物为乙酰氨糖等缺点。我们研究组主要开展体外合成生物学的研究，利用体外多酶体系实现了肌醇、果糖、栎醇等高值化合物的生产。因此，我们结合现有氨糖产业技术难点以及研究组的技术优势对本研究进行了深入调研并开发出了该新型氨糖生物制造平台。

Q：研究过程中遇到哪些挑战？

A：本项研究中最大的挑战是如何实现体外多酶体系的系统适配。针对该问题，我们通过酶资源挖掘及甄别筛选、计算模拟、反应体系优化等策略，极大提高了氨糖的产率和底物转化率。然而，关键脱磷酶的底物专一性差仍是本研究的另一个重要问题，我们研究组正在针对该挑战进行深入研究。

Q：该研究成果可能有哪些重要的应用？哪些领域的企业或研究机构可能从该成果中获得帮助？

A：该研究创制了一种绿色无污染、低成本、高底物转化率的新型氨糖生产技术，为氨糖相关企业的产业技术升级、产业化发展提供了具有自主知识产权的酶催化路线，具有明朗的工业化前景。相关技术不仅有助于氨糖及其衍生物的产业扩大化，同时有望带动以氨糖为主题的医药、化妆品、功能性食品及保健品的发展。