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Nature子刊:利用蛋白质快速光化学氧化与质谱连用解析蛋白质高级结构

蛋白质的高级结构(higher order structure,HOS)解析一直以来都是分析化学以及生物化学领域的热点课题。核磁共振谱学、蛋白质X射线晶体学以及冷冻电镜作为高分辨方法的代表为蛋白质结构解析做出了长足的贡献。近年来,质谱学(mass spectrometry)方法因其样品量需求低、高通量、可提供中高分辨率信息等优点也被越来越多的应用与蛋白质样品的表征分析。在众多基于质谱学的蛋白质表征方法中,足迹法(footprinting)利用化学试剂标记蛋白质的溶剂可及表面(solvent accessible surface)进而进行蛋白质结构的解析。蛋白质快速光化学氧化(fast photochemical oxidation of proteins,FPOP)作为足迹法的一种,具有标记不可逆、标记时间短(毫秒-微秒)、可利用自由基种类多、可标记氨基酸残基种类多等优点得到了广泛关注。

图1. 蛋白质快速光化学氧化法的主要应用


截至目前,蛋白质快速光化学氧化法已被应用于解决多种生物问题(图1),包括蛋白质的原位检测(in vivo)、配体结合亲和力测定、追踪淀粉样蛋白的沉积动力学、表征蛋白质折叠过程、确定抗原表位、计算机辅助蛋白质结构推断等。最为常用的标记试剂为通过248 nm激光照射分解过氧化氢产生的羟基自由基(•OH)。为了更好的推广这一强大的质谱学方法,圣路易斯华盛顿大学(Washington University in St. Louis)Michael L. Gross教授课题组在Nature Protocols 上发表方法描述文章。该文的第一部分详细介绍了如何从零开始搭建蛋白质快速光化学氧化表征平台,其中包括了列举全部所需的化学试剂以及仪器设备,选择激光器,搭建激光光路,搭建标记所需的流动系统,蛋白质样品处理,搭建适合分析蛋白质样品的高效液相色谱系统,液相色谱流动相的梯度设置与优化,质谱仪器的选择与参数设定,标记后的样品酶解,肽段以及氨基酸残基级别的数据采集,选用合适的软件进行数据分析等诸多技术细节。

图2. 蛋白质快速光化学氧化法的主要实验步骤


完成一整套蛋白质快速光化学氧化实验包括诸多步骤(图2),该文的第二部分详细地列出了准备蛋白质样品,进行快速光化学氧化标记,未消化的蛋白质(global-level)表征,标记条件的优化,标记蛋白的后处理与酶解,肽段以及氨基酸残基级别的数据采集与分析等。在详细介绍实验方法与步骤的同时,对每一步所需的时间也有所估算,并标记出了需要注意的重点步骤。更重要的是对于一些在实验过程中可能出现的问题与相应的解决方案亦有详细的介绍。


在最后的部分,作者以钙调蛋白(calmodulin)为例给出了一套详尽数据分析结果并推荐了数据可视化表达的方法,相应的原始数据也可通过文中的链接下载。读者可通过提供的原始数据进行数据分析联系,以更好的掌握蛋白质快速光化学氧化的方法。作者们希望通过这篇方法介绍推广这一具有广阔前景的质谱学技术以帮助更多课题组解决实际的蛋白质结构与生物学问题,同时欢迎具有合作意向的课题组前来进行联系与交流。


这一方法描述近期发表于Nature Protocols 上,文章第一作者为Washington University in St. Louis的博士生刘晓然,博士生刘晓然Michael L. Gross教授为共同通讯作者。


原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):

Protein higher-order-structure determination by fast photochemical oxidation of proteins and mass spectrometry analysis

Xiaoran Roger Liu, Don L. Rempel, Michael L. Gross

Nat. Protoc., 2020, DOI: 10.1038/s41596-020-0396-3


Michael L. Gross课题组简介


Michael L. Gross自1968年起在质谱领域独立开展研究工作。目前为圣路易斯华盛顿大学(Washington University in St. Louis)化学系,免疫系与药学系教授,同时担任圣路易斯华盛顿大学—美国国立卫生研究院质谱中心(NIH / NIGMS Biomedical Mass Spectrometry Resource)主任。课题组于2005年率先提出在流动系统中进行氢氧自由基的蛋白质标记(J. Am. Soc. Mass Spectom., 2005, 16, 2057-2063; Acc. Chem. Res., 2018, 51, 736-744; Chem. Rev., 2020, 120, 4355-4454),目前已成为与氢氘交换同等重要的蛋白质高级结构解析方法之一。课题组近期研究方向为利用质谱学方法结合氢氘交换,蛋白质快速氧化标记,蛋白质定向试剂标记,蛋白质化学交联等化学标记方法研究蛋白质高级结构。目标问题包括蛋白质折叠(J. Am. Chem. Soc., 2012, 134, 18724-18731),蛋白质沉积(淀粉样蛋白amyloid beta,alpha synuclein等,J. Am. Chem. Soc., 2016, 138, 12090-12098),膜蛋白结构解析(Nat. Struct. Mol. Biol., 2017, 24, 69–76),配体结合亲和力测定(Anal. Chem., 2019, 91, 12560-12567),发展新型标记自由基(Free Radic. Biol. Med., 2019, 131, 126-132)等。截止2020年,课题组已经发表文章超过700篇,被引用超过30000余次,Dr. Gross的h-index为87。


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