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DNA Equalizer Probes:有效扩大SNV检测窗口的新型核酸杂交探针

本文在理论和实验角度探究了核酸单点突变(SNV)的检测窗口问题,并创造性地提出了DNA Equalizer Probes(DEPs)这一新型核酸杂交探针。DEPs能够通过改变待测物与检测信号的定量关系有效调控SNV检测窗口,并在不损失检测灵敏度的前提下极大的拓展有效检测窗口,实现SNV高灵敏度和高特异性检测。该方法还具备使用简单、普适性强的特点,可以与聚合酶链反应(PCR)等核酸扩增技术无缝对接,成功实现了洪都拉斯贫困地区儿童寄生虫感染的同步检测及耐药筛查


核酸杂交探针贯穿于所有核酸相关检测及应用技术,比如PCR、原位杂交技术、链交换等等。理想的杂交探针往往需要具备高特异和高灵敏的特点。然而,由于杂交反应固有的热力学性质限制,往往灵敏度和特异性相互制约,很难实现二者兼得。研究者们通常聚焦于通过大量的模拟计算和实验(如设计分子信标和链交换探针,或者调整温度等)来获得最优杂交产率(灵敏度)和序列选择性(特异性)之间的权衡。然而,在目前的方法中,检测信号往往随着正确目标或者错误目标浓度单调递增(s形函数)。因此就存在产生假阳性的可能——某一特定信号既可能由低浓度的正确靶标产生,也可能由高浓度的错误靶标产生(图1a)。为了追求更好的特异性,现有的干扰杂交探针的策略都是通过扩大产生检测信号的吉布斯自由能差异来实现(图1b)。然而,当前策略的成功往往需要将检测窗口移向较高浓度为代价,因此牺牲灵敏度在所难免。与现有的所有方法不同,DNA equalizer probes (DEPs) 是通过从本质上改变检测信号和目标浓度之间的定量关系——从单调的s形函数转换为不对称的单峰函数——在不影响低浓度范围灵敏度的情况下拓宽检测窗口(图1c),实现SNV的高特异高灵敏检测。

图1. 识别单核苷酸变异的检测窗口的拓宽历程。


DEPs的工作流程和原理如图2所示。dsDNA AB通过95 ℃的快速加热产生单链目标A和它的互补序列B,迅速于冰浴孵育。然后B被DEPs优先杂交形成三链复合物而被消耗(图2b)。因此,A的产量是由DEPs的浓度定量决定的。当AB的浓度小于DEPs的浓度时,A是主要产物,尽管A和DEPs之间存在与B杂交的竞争(图2c)。当AB的浓度大于DEPs的浓度时,未被消耗的B将在复性过程中与A杂交(图2d)。因此,在较大的AB浓度范围内,A产率最大的浓度对应为DEPs的浓度。通过DEP探针,将传统的s型检测曲线转换为不对称的单峰曲线(图2d)。为了定量的描述检测窗口,作者引入了一个全新的参数——稳健性因子(Robustness factor, RF)。其定义为相同检出信号时错误靶标与正确靶标的浓度比(图2d)。

图2. DEG(DNA equalizer gate)的示意图。(a) 使用DEG定量检测dsDNA的工作流程。(b) DEG具体的反应原理。杂交探针(DEP)与dsDNA中AB的数量相对大(c)和少(d)情况时,对应的反应示意图。(e) DEG的引入从根本上改变靶标浓度和检测信号的定量关系的理论结果。


为了定量模拟和预测DEPs在扩大检测窗口和提高序列选择性方面的有效性,作者建立了如图3所示的数学模型。图3a为整个反应网络中可能存在的反应情况,并引入化学计量矩阵RM来帮助简化计算(图3b)。该模型可以成功预测[AB]<[DEPs]时A和AB的产率(图3c),但是对于[AB]>[DEPs]的情况与实验结果不符。因此,作者引入了一个概率数学模型进行修正(图3d),从而最终正确反映了每个DNA组分的平衡分部(图3e)。

图3. DEG的理论模型。


利用数学模型,作者首先在DEG的三个关键因素(包括DEPs定义的靶标浓度、序列设计和检测窗口)的基础上定量分析了产率(η)、区分因子(DF)和稳健性因子(RF)。ssDNA可以被视作DEP浓度为无穷的时候(即A的产率为100的时候),ssDNA也能够用该模型预测。他们分别模拟了从检测ssDNA([DEP]的浓度为∞)到在50 nM、100 nM、200 nM和500 nM不同浓度下检测dsDNA的理论转化,其模拟结果如图4所示。值得注意到是,当超过一定的目标浓度时(图4a),在DEP([T]max = [DEPs])所定义的单一目标浓度下,DEG中存在一个最大的相对浓度(图4b)。该特点使得DEG的检测窗口显著扩大,从而能够实现对SNV的高度特异性识别,减少了假阳性(图4d)。区分因子(Discrimination factor, DF)的改善程度也可以通过DEP的浓度来确定(图4d)。由于高浓度SNV被单独抑制,因此观察到RF从有限值(图4e)到无限值(图4f)的显著转变。

图4. DEG的模拟结果。在理论模拟时,经典的链交换反应(a)和DEG随着DEP不同浓度变化(b)时反应产率随着靶标浓度的函数变化。经典的链交换可以考虑成DEG的一种特殊情况,即[DEP]=∞。当[AB]=[DEP],DEG的产率最大。错误靶标的产率将会随着浓度的范围的变宽而抑制,这将有利于拓宽检测窗口,提高检测的特异性。链交换反应(c)和DEG (d)的DF的预测。随着DEP浓度的变化,SNV的检测窗口是可调的。链交换€和DEG (f) 的RF的理论模拟。


作者用实验对上述模拟结果进行了验证,结果如图5所示。其实验结果与理论模拟完全一致。表明DEG能够按预期一样运转。

图5. DEG的实验验证。


一种实际适用的DNA杂交探针应该与常用的核酸扩增技术(如PCR)兼容。由于DEP探针直接作用于dsDNA,它是分析dsDNA扩增子的理想探针。因此,接下来作者验证了DEG对PCR的适应性(图6)。首先,他们设计了一套4个DEPs,用于具有代表性的87bp dsDNA扩增子(图6a),结果表明4个DEPs也能用于构建DEG(图6b)。为了避免可能发生的交叉反应,作者特意设计了两个外部DEPs,它们与PCR引物相同(图6c)。图6d的结果表明,DEG-PCR既具有高灵敏也高特异,低至1aM的合成DNA模板都能够被检测。而且,此时错误的靶标的信号完全被DEG抑制,甚至比MT的1aM的信号还要低(图6d)。相比之下,当使用不对称PCR产生可检测的ssDNA扩增子,然后使用相同链交换报告基因读出时,检测窗口(高于1 fM)被观察到(图6e、6f),表明DEG的优势所在。

图6. 整合DEG和PCR。


最后,作者使用DEG-PCR技术,利用从洪都拉斯农村地区的学龄儿童收集的临床样本,对其土壤传播寄生虫(STH)感染诊断和耐药性筛查(图7)。设计了两个荧光报告基团来检测Trichuris trichiura β-tubulin基因的196-203和206-213密码子(图7b)。首先使用双通道DEG-PCR检测不同浓度的合成DNA和13个具有没有抗性的临床TT样本,结果如图7c所示。用统计学对大量样本结果进行统计,结果表明其中三个区域(99%置信)可定义为阳性感染和阳性耐药性(D.R+),反之定义为阳性感染但阴性耐药性(D.R-)和未检测到的感染(N.C.)。对洪都拉斯接受阿苯达唑治疗的患者排出的6份临床寄生虫标本进行检测,发现TT阳性但无耐药性(图7d)。两份作为阴性对照的临床蛔虫标本也进行了检测,发现TT阴性。

图7. DEG-PCR在临床寄生虫标本分析中的应用。


本文第一作者是布鲁克大学-四川大学联合培养博士研究生王冠,通讯作者是四川大学李峰教授。李峰教授2014年底受聘于加拿大布鲁克大学(Brock University)化学系任助理教授,后升任副教授并荣获终身教职,2019年归国在四川大学化学学院建立Analytical DNA Nanotechnology Laboratory (ADNLab),并长期致力于分析化学与DNA纳米技术的交叉学科研究,旨在深度研究DNA纳米技术的基本化学原理,从而为化学测量及疾病体外诊断提供更好的工具。


原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):

Expanding detection windows for discriminating single nucleotide variants using rationally designed DNA equalizer probes

Guan A. Wang, Xiaoyu Xie, Hayam Mansour, Fangfang Chen, Gabriela Matamoros, Ana L. Sanchez, Chunhai Fan, Feng Li

Nat. Commun., 2020, 11, 5473, DOI: 10.1038/s41467-020-19269-9


导师介绍

李峰教授课题组网站介绍:

http://ligroupscu.mysxl.cn/

https://www.x-mol.com/groups/li_feng_scu


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