Huaxi-Fluors——新型生物正交荧光探针骨架的发现

近年来，四嗪生物正交化学已经被广泛地应用于前药精准释放、蛋白功能调控、免疫分子影像、活细胞荧光成像等多个生物医药的研究领域，其作为诊疗工具的临床转化也在积极进行。在这些生物医学应用中，常常将四嗪分子与常用的荧光团偶联，利用四嗪的自身物理化学性质对荧光进行淬灭而通过生物正交反应实现荧光的开启，从而进行高信噪比和分辨率的活细胞活体荧光成像。而由于四嗪大多只对发射波长为580 nm以下的荧光分子具有较好的淬灭效果，而处于远红、近红外的荧光分子难以被淬灭。近十年来，科学家们对四嗪荧光探针设计有许多尝试，但鲜有超过100倍荧光增强的近红外探针报道。开发这类荧光探针可增强荧光的组织穿透距离，避免体内自发荧光干扰，为哺乳动物的活体高分辨荧光成像和光学手术导航打下基础。

近日，四川大学华西医院吴昊星课题组通过新的设计策略构建了新型荧光体系，该体系为电子供体–π–受体（D–π–A）四嗪染料体系，并利用四嗪生物正交反应调控激发态分子内电荷转移（ICT）过程。首先，该团队以苯胺为电子供体，四嗪为电子受体，利用课题组前期报道的方法（Angew. Chem. Int. Ed., 2019, 58, 1106 –1109）合成了包括多种不同π-共轭体系的四嗪探针（Scheme 1）。由于四嗪极度的缺电子特点（低能量的LUMO轨道），使得四嗪染料的荧光完全淬灭。与亲二烯体如环辛炔（BCN）发生生物正交反应后，电子受体由四嗪转变为哒嗪，获得了具有ICT效应的荧光产物，实现荧光从“无”到“有”的变化。其中，以π桥噻吩组成的四嗪染料HF₆₄₂能够实现961倍的荧光增强，同时具有量子产率高和Stokes位移大等优异光学特征。因此，该课题组将这种具有四嗪-噻吩-电子供体的荧光骨架体系命名为Huaxi-Fluors（HFs）。

随后，团队通过对共轭体系长度、电子供体/受体的推拉能力的调控进一步设计得到了一系列HFs荧光探针。这些探针的发射波长覆盖556 nm到728 nm，且发射波长具有规律性和可预测性。探针在反应前荧光几乎完全淬灭，而生物正交反应后有数百倍的荧光开启，同时它们具有大于150 nm的斯托克斯位移、较高的荧光量子产率和双光子吸收截面积等特点。作者同时通过计算化学的密度泛函理论对染料设计进行了验证，进一步阐明了Huaxi-Fluors设计的合理性。

Scheme 1. The strategy for fluorophore in situ formation by tetrazine bioorthogonal reaction.

Table 1. Construction of conjugated systems with various π linkages and photophysical properties of the corresponding fluorophores formed by reaction with 6.

Scheme 2. Chemical structures of “Huaxi-Fluors” and fine-tuning of their photophysical properties.

Figure 1. Changes in electron density upon electronic excitation of HF₆₄₂ and Pz₆₄₂.

这类探针在生命环境中有较高的化学稳定性，对酸碱不敏感，且光学稳定性优于一些商品化探针。吴昊星课题组利用该探针成功地实现了对亚细胞结构的选择性标记（皮尔森系数：0.94–0.95），具有优异的信噪比（14–111倍）。同时实现了此类荧光探针对小鼠移植瘤的免疫预定荧光成像，这类荧光成像方法的实施有助于避免传统免疫荧光成像所用探针长时间生物循环造成的降解，从而提高活体水平的靶标检测灵敏度。

Figure 2. No-wash imaging of lysosomes and mitochondria in live cells using HF₆₄₅.

Figure 3. Imaging of HF₆₄₅ fluorescence in mice in vivo, major organs ex vivo and two-photon imaging on tumors in vivo.

研究团队相信该工作所构建的具有远红/近红外发射的四嗪生物正交荧光探针体系（Huaxi-Fluors）将在在分子影像、生物医学等领域具有较好的应用前景。

相关研究结果发表于近期的Angewandte Chemie International Edition，第一作者为四川大学华西医院博士后毛梧宇。相关工作受到国家自然科学基金、中国博士后科学基金等项目的资助。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

A general strategy to design highly fluorogenic far-red and near-infrared tetrazine bioorthogonal probes

Wuyu Mao, Jie Tang, Liqun Dai, Xinyu He, Jie Li, Larry Cai, Ping Liao, Ruotian Jiang, Jingwei Zhou, Haoxing Wu

Angew. Chem. Int. Ed., 2020, DOI: 10.1002/anie.202011544

吴昊星课题组

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