荧光成像是生物研究和临床诊断中常见的可视化技术之一。有机染料由于可以提供多种不同的发射颜色以满足对复杂生物环境观察的需求，是目前广泛使用的荧光成像探针。三重态是有机荧光团普遍存在的激发态，这种激发态可以与氧分子发生相互作用产生活性氧物种(ROS)，从而造成有机染料的氧化降解 (光漂白)，难于满足长时间荧光成像的需求。将有机染料掺入二氧化硅基质中，可以减少有机染料与氧分子接触的机会，从而在一定程度上改善其光稳定性。然而，无定形二氧化硅基质具有多孔结构，通常完全阻挡氧分子的进入。研究具有良好稳定性的荧光成像探针，可以为实现生物学研究和临床诊断中生理过程长时间动态观察提供有实用价值的探针材料。

基于以上问题，我们发展了一种通过有机-无机杂化提高荧光探针稳定性的方法。花青(Cy)染料是一类由含有奇数碳原子的多次甲基桥连接两个含氮杂环构成的化合物，是目前生物研究和临床诊断中广泛使用的一类荧光成像探针，在光照下易发生氧化降解。我们发现含有七个碳原子次甲基桥的Cy染料（ICG）与(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS)可以发生加成反应形成具有红色发光的有机硅纳米粒子(OSi NPs)。通过优化反应中ICG和APTMS的摩尔比，制备的OSi NPs荧光量子产率可达达到32%，并且具有良好的光稳定性和生物相容性，可以实现长时间细胞成像。

图1. (A) ICG与APTMS反应前后的紫外可见吸收光谱。(B) ICG与APTMS反应摩尔比对荧光量子产率的调控。(C) ICG与APTMS反应机制验证实验。(D) ICG与APTMS反应机制与产物结构示意图。

通过ICG与APTMS反应前后的吸收光谱变化及荧光发射光谱的变化可以推测ICG与APTMS发生了加成反应使得ICG的共轭结构发生变化。通过ICG与APTMS和TCEP反应的对照实验可以验证该推测的合理性，反应机制和产物结构图(D)所示。

图2. (A) OSi NPs的透射电镜照片及粒径分布统计图。(B) OSi NPs的MALDI-TOF质谱图。(C) OSi NPs的发射光谱随激发光红移时的变化。(D) OSi NPs的发射光谱随溶剂极性的变化。

合成的OSi NPs其平均尺寸为3.5 nm。MALDI-TOF质谱中m/z=2618.9的强峰可归属为[(ICG')₂(hAPTMS)₉+Na]⁺，由此可以确定OSi NPs的组成为(ICG')₂(hAPTMS)₉。OSi NPs的最大发射峰位随着激发波长的改变其发射强度发生变化，但峰位未发生明显移动，表明OSi NPs的发光具有分子荧光的特性。OSi NPs的发射峰位随着溶剂极性的增大发生明显的红移，进一步证实OSi NPs的发光具有分子荧光的特性。

图3. (A) OSi NPs的发光强度随着储存时间的变化。(B) OSi NPs的发光强度随NaCl与KCl浓度的变化。(C) OSi NPs的发光强度随PBS缓冲溶液与DMEM培养液pH值的变化。(D) 不同浓度OSi NPs在光照与避光条件下的细胞毒性。

图4. (A) OSi NPs与Cy5染料标记的细胞随光照时间变化的荧光显微镜照片。(B) OSi NPs与Cy5染料在长时间光照条件下的发射强度变化。(C) OSi NPs与Cy5染料的荧光寿命。(D) OSi NPs与Cy5染料的发射强度随着单线态氧产生的变化。

稳定性评价结果表明所制备的OSi NPs在室温条件下储存30天，其荧光强度未发生明显变化。在分散盐溶液或不同pH缓冲液和培养液中时，粒子仍保持良好的发光特性。细胞毒性试验表明OSi NPs在400 μg/mL时，在光照或避光条件下细胞存活率都在80%左右，具有良好的生物相容性，适用于活细胞荧光成像。使用OSi NPs作为标记物，在光照30 min后仍可以观察到清晰的细胞轮廓，而花青染料Cy5在光照5 min后易发生明显的漂白。动力学研究结果与花青染料相比，OSi NPs的辐射跃迁速率更快，有效抑制了单重态向三重态的转化以及单线态氧的产生，具有更好的抗漂白能力。

本研究的相关结果作为(内页)封面文章已发表于ACS Applied Bio Materials, Volume 3, Issue 8。本项目得到了中国国家自然科学基金委员会(No. 21773089, 51372097)的支持。

ACS Applied Bio Materials 创刊于2018年7月，仅在线出版，12期/年。旨在为读者及作者提供生物相关功能材料的设计及其应用的突破性与原创性研究，是将材料学、工程学、生物学、医学及化学知识融合于重要的生物应用的前沿期刊。

涵盖研究领域包括生物材料，生物医用材料，生物能源，生物催化，生物电子，生物污损与防污材料，仿生材料，生物分子成像/传感，药物传递/靶向，自修复材料，抗菌/抗微生物及抗癌生物材料等。