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基于荧光聚合物点的多色受激辐射损耗(STED)超分辨成像技术

实时追踪细胞内细胞器、囊泡等相互作用对于解析生命活动中诸多生化过程的分子机制至关重要。多色受激辐射损耗超分辨显微技术(STED Nanoscopy)具有突破衍射极限的超高分辨率、成像速度快、无需特殊的闪烁荧光基团等优势,能够提供活细胞内生物分子的精确定位,是新兴的纳米尺度亚细胞研究重要工具。然而,活细胞多色STED显微技术的广泛应用仍然受限于缺乏抗漂白的荧光基团和复杂昂贵的成像设备。


STED显微术利用一束常规激发光和一束超高强度的环形损耗光共同照射荧光基团,以实现超分辨成像。由于损耗光强度往往是激发光的数百至数千倍,导致荧光基团快速漂白。此外,每种荧光基团都需要各自的激发光和损耗光共同照射,在双色乃至多色超分辨成像时往往需要四束乃至更多的激光进行纳米尺度的精确耦合,这对成像设备光路系统的准确性、稳定性和成本都具有极高的要求。


中国科学院化学研究所方晓红点击查看介绍团队开发的抗漂白双色荧光半导体聚合物点组合能够有效克服这些限制,并简化复杂的光路系统。他们设计合成了具有不同发射波长 (Em) 的两种荧光半导体聚合物点 (Pdots):CNPPV Pdots(Em:604 nm)和PDFDP Pdots(Em:663 nm)用于双色STED超分辨成像和活细胞示踪。这两种聚合物点纳米探针都具有高亮度、抗漂白、易于修饰靶向基团、生物相容以及大斯托克斯位移的特性,能够共用同一束激发光和损耗光进行双色超分辨成像,因此有效简化了成像光路。对两种聚合物点进行单颗粒成像,分别获得了78纳米和68纳米的超高分辨率。通过修饰链霉亲和素,聚合物点可以特异性标记细胞内外结构和靶蛋白。

图1. 两种聚合物点颗粒的表征及STED超分辨成像。图片来源:方晓红课题组


他们将两种聚合物点探针分别标记由网格蛋白(clathrin)和小窝(caveolae)介导的内吞途径来源的内涵体,并长时间示踪其动态相互作用。由于内涵体囊泡的尺寸小于光学衍射极限(250纳米),STED超分辨成像技术能够更准确观察到内涵体囊泡间的相互作用。他们发现不同来源内涵体囊泡间存在“kiss-and-run”和“fusion-and-fission”的两种动态相互作用模式,并可以在模式间发生切换,在相互作用的同时发生了囊泡间的货物交换。据此,他们提出了新的内涵体囊泡间动态相互作用模型。

图2. 双色STED超分辨成像和活细胞囊泡动态示踪模型。图片来源:方晓红课题组


以上研究表明,荧光半导体聚合物点这类新型纳米探针在活细胞多色STED超分辨成像领域具有广阔的应用前景。这一成果近期发表在Analytical Chemistry 上,文章的第一作者是中国科学院化学研究所的吴亚运博士,通讯作者是中国科学院化学研究所的方晓红研究员和袁景研究员。


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Fluorescent Polymer Dot-Based Multicolor Stimulated Emission Depletion Nanoscopy with a Single Laser Beam Pair for Cellular Tracking

Yayun Wu, Hefei Ruan, Zaizai Dong, Rong Zhao, Jianqiang Yu, Xiaojun Tang, Xiaolong Kou, Xing Zhang, Manchen Wu, Fang Luo, Jinghe Yuan,* Xiaohong Fang*

Anal. Chem., 2020, 92, 12088–12096. DOI: 10.1021/acs.analchem.0c02821


方晓红研究员简介


方晓红,中国科学院化学研究所研究员,博士生导师,兼任中国科学院大学教授。1996年于北京大学化学系取得博士学位,1997年至2001年在滑铁卢大学、佛罗里达大学工作,2001年12月起就职于中国科学院化学研究所,任分子纳米结构与纳米技术重点实验室研究员。2002年获得国家杰出青年科学基金资助。在发展高灵敏度的生物医学分析新方法、单分子水平研究生物分子相互作用、细胞信号转导相关蛋白的活细胞单分子研究、超分辨成像等方面取得了高水平的研究成果。已在PNAS、JACS、Angew. Chem. Int. Ed.、等国际学术期刊上发表论文200多篇。主持和作为主要成员承担和完成了国家自然科学基金委杰出青年基金、重大、重点基金和国家科技部、卫生部等多项科研项目, 2007-2017年两次担任科技部纳米重大科学研究计划项目首席科学家。应邀担任美国化学会Analytical Chemistry 副主编和Int. J. Nanomed.、ChemPhysChem、Sci. China-Chem.、Chin. Anal. Chem.、Chemical Research in Chinese Universities等SCI国际期刊编委。


https://www.x-mol.com/university/faculty/250556


袁景和研究员简介

袁景和:中国科学院化学研究所项目研究员,2002年获得南开大学光学工程专业博士学位。主要研究领域包括:超分辨光学显微成像仪器,单分子数据处理算法研究。实现了超连续脉冲激发的STED超分辨成像仪器,并应用于生物医学成像研究。实现了基于统计和深度学习单生物分子数据分析算法。已经发表相关科研论文60多篇。


https://www.x-mol.com/university/faculty/178043


科研思路分析


Q:这项研究最初是什么目的?或者说想法是怎么产生的?

A:我们课题组在搭建国产化STED超分辨成像仪器和生物成像应用方面取得了一些重要进展,但是常规荧光蛋白和染料的稳定性不足以用于长时间的超分辨成像,我们想到利用纳米颗粒,在发现荧光半导体聚合物这类抗漂白的纳米探针之后,首次将其应用于长时间STED超分辨生物成像(Adv. Optical Mater., 2018, 6, 1800333)。本工作是我们之前工作的延续,我们课题组继续开发了另一种发射波长的聚合物点探针,以发挥超分辨成像在相互作用研究中可进行更准确的共定位、共运动分析的优势。我们利用半导体聚合物点具有大斯托克斯位移的特性,进行了双色STED成像光路简化和活细胞内两种囊泡示踪的研究,拓展了半导体聚合物点这类纳米探针在超分辨成像领域的应用, 并发现了内吞囊泡新的相互作用模式。


Q:研究过程中遇到哪些挑战?

A:本项研究中面临的挑战包括如何设计可用同一束激发光和损耗光激发的两种聚合物点纳米探针,小尺寸纳米探针的合成,激发/发射条件和成像光路的确定,活细胞囊泡标记方法的选择及数据分析。在这个过程中,我们团队在超分辨成像系统搭建方面的经验积累起了重要作用。


这项研究属于化学、物理和生命科学交叉学科的研究。我们团队在分析检测、生物成像、光学仪器等方面的基础较好,希望能够与聚合物探针分子结构设计及化学合成方面的专家一起推进超分辨成像探针的发展及应用。


Q:该研究成果可能有哪些重要的应用?

A:我们的研究成果提供了一对能够直接用于长时间STED超分辨成像的抗漂白纳米探针,可以利用简化的光学设备进行超分辨双色成像。研究工作展现了荧光半导体聚合物点作为超分辨成像探针的独特优势,它们将在细胞结构和功能成像、细胞器和生物分子互作、疾病分子机制和药物作用机制等研究领域具有广泛的应用前景。未来希望能够开发出更多专门为STED成像设计的不同种类新型荧光探针,进一步推进多色STED超分辨成像技术在纳米尺度生命化学研究中的应用。


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