以多聚硫为直接硫源的麦角硫因生物合成

近日，波士顿大学化学系刘平华、崔强实验室联合中科院上海有机所周佳海团队等发现多聚硫（Polysulfide）可作为麦角硫因（Ergothioneine）厌氧生物合成途径的硫源给体，EanB能直接催化惰性C-H键并将其转化为C-S键。这是目前发现的第一个以Polysulfide为底物的酶反应，相关成果在线发表在ACS Catalysis 期刊上。

硫，是组成生物体细胞成分的基本元素，而硫化物也广泛存在于生命进程、药物分子、光电材料、香精香料以及许多食品中。近年来，合成生物学发现了很多生物合成途径都与C-S键的形成密切相关，比如芥子油苷、林可霉素、硫代珊瑚素、胶质毒素和植物抗毒素等。尤为注目的是，被誉为“长寿维生素”的麦角硫因（Ergothioneine，4）也是一种来源于植物或真菌并且可以在动物中积累的硫醇-组氨酸衍生物（图1），许多疾病都可从其治疗中受益，比如类风湿性关节炎、克罗恩病和糖尿病等。

麦角硫因的生物合成途径包括两条有氧途径（在分枝杆菌中为EgtB-EgtC-EgtE催化,在真菌中为Egt1-Egt2催化）和一条厌氧途径（在硫细菌中为EanB催化）。具体来说，在有氧途径中，非血红素铁酶EgtB或Egt1（图1a）以氧分子为氧化剂，以催化Hercynine（1）的ε-位的C_sp2-H键活化为起始反应点；在厌氧途径中，半胱氨酸脱硫酶EanB则直接催化ε-位的C_sp2-H键生成C-S键（图1a），这一过程中可能是以Cys为硫源，而IscS则扮演硫转移的媒介（图1b）（Nature, 2014, 510, 427−431; Angew. Chem. Int. Ed., 2017, 56, 12508−12511）。

图1. 麦角硫因生物合成和EanB的功能鉴定

在该研究中，刘平华课题组发展了一种偶联检测麦角硫因的手段，先将麦角硫因降解为化合物（5），该化合物具有以311 nm为中心的强吸收特征（ε_311nm=1.8×10⁵ M^-1•cm^-1），因此监测311 nm处的峰值即可测量麦角硫因的生成量。这一方法不仅比文献中利用¹H-NMR检测简便，而且还可以准确测定酶EanB相关的动力学参数。当利用新方法对已报道文献中IscS-EanB酶偶联的麦角硫因检测时，刘平华课题组得到了两个意外的发现。首先，化合物（5）的形成具有5 min滞后阶段（图1d）。其次，反应混合物在4 h后变得浑浊，分析推定其主要成分是单质硫（S8）。值得一提的是，有文献指出，当使用IscS作为硫转移介质时，如果不存在合适的硫受体，IscS催化将导致单质硫（S8）的积累（Acta, Mol. Cell Res., 2015, 1853, 1470−1480; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1993, 90, 2754-2758.）。因此，基于麦角硫因酶偶联测定的结果，他们推测Cys-IscS可能不是EanB催化的直接硫源。

为了找到真正的硫源，刘平华课题组测试了EanB催化的可能的潜在硫供体，包括硫代硫酸盐（Na₂S₂O₃）、巯基丙酮酸（3-MP）、双硫化物（NaHS）和多聚硫（Polysulfide）等。实验结果表明，只有多聚硫支持麦角硫因稳定的产生，而且二硫苏糖醇（DTT）处理单质硫（S8）用以产生多硫化物也显著提高了麦角硫因的产量。更重要的是，当多聚硫为直接硫源时，EanB-麦角硫因酶偶联试验不存在任何滞后。同时，测得野生型EanB（EanB-WT）的稳态动力学参数为Hercynine（1）的k_cat为0.68±0.01 min^-1，K_m为69.7±8.7 μM，多硫化物的K_m为18.1±1.2 μM。随后，他们对多聚硫的组成进行了表征，发现其主要形式为S₄^2-。后续的单周转实验也进一步支持了多聚硫为EanB催化中的直接硫源。

为了更加系统地阐释EanB催化C-S键形成的机理。周佳海课题组运用X-ray晶体衍射解析了不同状态的EanB复合物结构，清晰地呈现了EanB催化反应的不同过程。考虑到多聚硫在有氧环境下易于浑浊而形成不溶的S8，蛋白纯化和复合物的晶体生长均在手套箱中完成。通过与Hercynine（1）和多聚硫的共晶，周佳海课题组成功捕捉到过硫化Cys412-EanB与（1）复合物晶体结构。在Cys412-EanB-1晶体结构中，Cys412的过硫化末端硫与（1）的ε-C之间的距离为3.2 Å，远长于正常的C-S键（〜1.82 Å）。同时，过硫化Cys412与（1）的咪唑环之间的二面角为-141.8°。因此，这种结构很可能是硫转移反应之前的状态。在这种反应前状态中，Tyr353与（1）的ε-C距离为3.1 Å，表明其在酸/碱催化中的潜在作用，并通过EanB_Y353A和EanB_Y353F突变体得到了验证。此外，突变实验、¹H-NMR和质谱表征结果也表明Cys412是EanB五个半胱氨酸中唯一的催化半胱氨酸。

将EanB_Y353A与多聚硫和（1）进行共晶，周佳海课题组成功的观察到另外两个状态，即EanB_Y353A-hercynine-过硫化共价中间体（图2b）和EanB_Y353A-麦角硫因与过硫化Cys412二元复合物（图2c）。对于EanB_Y353A，Tyr355的-OH更接近于（1）的ε-C（4.0 Å），部分填补了Tyr353在EanB_WT中占据的空间。此外，在EanB_Y353A突变体复合物结构中，Cys412呈三硫键形式，而不是在EanB_WT中的二硫键形式，这可能是由于将Tyr353突变为较小的Ala残基而产生了额外的空间（图2b）。更重要的是，过硫化物直接以四面体构型与Hercynine（1）的ε-C相连，暗示这种状态是捕获的包含四面体中间体的C-S键。对于带有过硫化Cys412的EanB_Y353A-麦角硫因二元复合物（图2c），作者将此结果归因于该突变体非常低的活性水平，以及在长达两周的结晶过程中一些四面体中间体的产生可能导致了该产物的形成。

随后，崔强课题组对反应前状态的晶体结构实施了QM/MM计算模拟，推测了C-H键活化，C-S键形成以及S-S键断裂的机理。结果表明：能量上有利的途径从Tyr353的（1）的N_π质子化开始，产生了亚稳态的中间体IM-1。在EanB预反应状态中，Thr414和（1）的N_π间的氢键利于锚定（1）进而使其在高效的质子转移和稳定去质子化的Tyr353中发挥关键作用，相应的生化实验也进一步证实了这些残基的功能。从IM-1或IM-2开始，硫转移和质子转移回Tyr353的过程可能会历经多种途径，如图2d。简单来说，路径II的活化能比路径I高得多；在路径III中，（1）的咪唑环率先被Tyr353质子化，然后去质子化的Tyr353紧接着进攻（1）的ε-C位使其去质子化，生成卡宾中间体。此外，S-S键断裂在三个途径中均具有更高的活化自由能表明，与溶剂和底物KIE数据一致，质子转移反应不是限速步骤。因此，QM/MM研究表明，（1）的咪唑侧链被Tyr353质子化是EanB催化中引发S-S键断裂的关键活化步骤。

图2. EanB催化中的三种状态晶体结构和基于QM/MM计算的EanB机理模型

总的来说，该研究通过生化实验证明了硫细菌中不同形式的多聚硫是EanB酶催化反应的直接硫源，结合动力学研究、质谱分析、和反应过程中不同状态的复合物晶体结构详细地阐明了EanB催化的反应机理。同时，综合生物化学、结构生物学和计算化学结果，就多聚硫的转移反应提出了机理模型。

刘平华课题组的博士生Ronghai Cheng、Nathchar Naowarojna、周佳海课题组的助理研究员吴联、崔强课题组的博士生Rui Lai以及国家蛋白质上海设施的彭超博士并列论文第一作者。该工作得到了国家重点研发计划“合成生物学”重点专项、中科院先导项目C和上海市优秀学术带头人项目的资助，晶体衍射数据是在上海光源BL17U1和国家蛋白质设施BL18U1、BL19U1收集的。

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Single-Step Replacement of an Unreactive C–H Bond by a C–S Bond Using Polysulfide as the Direct Sulfur Source in the Anaerobic Ergothioneine Biosynthesis

Ronghai Cheng, Lian Wu, Rui Lai, Chao Peng, Nathchar Naowarojna, Weiyao Hu, Xinhao Li, Stephen A. Whelan, Norman Lee, Juan Lopez, Changming Zhao, Youhua Yong, Jiahui Xue, Xuefeng Jiang, Mark W. Grinstaff, Zixin Deng, Jiesheng Chen, Qiang Cui*, Jiahai Zhou*, Pinghua Liu*

ACS Catal., 2020, 10, 8981–8994, DOI: 10.1021/acscatal.0c01809