含5-羟基色胺酸为第21种氨基酸的大肠杆菌的构建及应用

大部分的物种使用20种天然氨基酸去合成蛋白质。但是很多报道展示了生物体需要更高层次的化学多样性去实现复杂的生物学功能，这其中包括可以改变蛋白质功能的翻译后修饰，增强酶功能的辅助因子，包含非天然氨基酸的非核糖体肽。这些发现暗示了拥有第21个氨基酸的生物可以利用额外的这种氨基酸去构建更加复杂的蛋白质和进行更加多样化的物种进化。创造这样的物种，需要满足以下三个条件：正交翻译体系、可用的密码子以及第21种氨基酸的生物合成。生物正交的氨酰-tRNA合成酶已经可以用终止密码子来编码超过200种非天然氨基酸。四连体密码子、重新编码的基因组和非天然碱基对又给非天然氨基酸提供了更多可以使用的密码子。但是，可以进行遗传密码扩展的非天然氨基酸的生物合成路径很少被报道。这是因为大多数可以修饰氨基酸侧链的酶都是识别在多肽或是聚酮合成酶上的氨基酸，而生物正交翻译体系使用的是单独的非天然氨基酸。

近期，美国莱斯大学Han Xiao（点击查看介绍）团队报道了一种包含5-羟基色胺酸作为其第21种氨基酸的大肠杆菌，这种大肠杆菌可以在其体内生物合成5-羟基色胺酸并且把其定位编码到蛋白质上。作者证明了这个包含5-羟基色胺酸作为其第21种氨基酸的大肠杆菌可以被用来制备抗体荧光分子定点偶联体以及检测细菌的氧化压力。

图1. 含5-羟基色胺酸为第21种氨基酸的大肠杆菌及其应用。图片来源：Chem

作为动物体内合成血清素的前体，5-羟基色胺酸可以在体内由色氨酸羟化酶以色氨酸和tetrahydrobiopterin (BH4) 合成。除了使用真核生物的羟化酶，来自原核生物的苯丙氨酸羟化酶也可以被改造成可以识别色氨酸的羟化酶。这些原核生物的羟化酶会使用tetrahydromonapterin (MH4) 作为辅助因子。为了找到最好的羟化酶去在大肠杆菌中产生5-羟基色胺酸，作者筛选了来自不同物种的羟化酶并发现来自Xanthomonas campestris 的苯丙氨酸羟化酶具有最优的效果。作者随后对生物合成以及遗传编码的各组分进行进一步的验证和优化。为了证明利用生物合成的5-羟基色胺酸进行遗传编码扩展的效率和准确性，作者从改造后的细菌中提取了含有5-羟基色胺酸在151位置的绿色荧光蛋白并且发现了不错的蛋白产量和与预计一致的蛋白分子量。为了进一步确定5-羟基色胺酸生物合成的效果，作者还测量了细菌内的5-羟基色胺酸含量。

图2. 构建含5-羟基色胺酸为第21种氨基酸的大肠杆菌细胞。图片来源：Chem

作为一个含有富电子吲哚环的氨基酸，5-羟基色胺酸还具有生物正交反应特性。为了证明从改造后细菌中提取出来的蛋白是否可以被定点修饰，作者表达了在113位含有5-羟基色胺酸的HER2抗体片段（anti-HER2-5HTP）。质谱和蛋白胶证明了目标蛋白合成的准确性和产量。在优化的反应条件下，作者实现了anti-HER2-5HTP与coumarin-diazonium的生物正交反应并且验证了反应产物靶向HER2高表达细胞的能力。

图3. 含5-羟基色胺酸为第21种氨基酸的大肠杆菌细胞的蛋白定点修饰。图片来源：Chem

利用5-羟基色胺酸生物合成过程还原性辅助因子的参与，作者还提出了用含有5-羟基色胺酸作为其第21种氨基酸的细菌来测量氧化还原压力。作者猜想随着细菌氧化压力水平的升高，还原性辅助因子会被消耗以致其不能用来供给5-羟基色胺酸的生物合成，这样细胞内5-羟基色胺酸的水平会降低，然后导致绿色荧光蛋白的表达量就会降低。为了证明这个猜想，作者先测量了在不同浓度过氧化氢处理下细菌中5-羟基色胺酸的含量，并且发现其浓度随着过氧化氢浓度的增加呈现逐渐减少的趋势。然后作者测量了在不同过氧化氢处理下细菌中荧光蛋白的亮度，并且发现拥有5-羟基色胺酸作为其内在氨基酸的细菌对于过氧化氢处理有很高的灵敏度。

图4. 含5-羟基色胺酸为第21种氨基酸的大肠杆菌细胞可用于氧化压力检测。图片来源：Chem

现今尽管越来越多的非天然氨基酸可以被遗传编码，但是这个过程需要额外添加化学合成的非天然氨基酸到培养体系，而且非天然氨基酸可以成功进入细胞。这些特点影响了使用非天然氨基酸进行进化研究以及研制新型生物疗法的应用，比如大部分非天然氨基酸具有很差的药代动力学特性，在几个小时内就会被清除。通过结合生物正交反应体系、遗传编码扩展、非天然氨基酸的生物合成，希望可以设计出更多的具有非天然氨基酸作为内在氨基酸的细胞和物种，这样会给蛋白进化以及研制新的蛋白/细胞疗法提供强大的工具。

这一成果近期发表在Chem 上。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Creation of Bacterial Cells with 5-Hydroxytryptophan as a 21^st Amino Acid Building Block

Yuda Chen, Juan Tang, Lushun Wang, Zeru Tian, Adam Cardenas, Xinlei Fang, Abhishek Chatterjee, Han Xiao

Chem, 2020, DOI: 10.1016/j.chempr.2020.07.013

研究团队简介

Han Xiao教授本科毕业于中国科学技术大学化学系，师从龚流柱教授。研究生毕业于Scripps化学系Prof. Peter G. Schultz实验室，随后在斯坦福大学化学系Prof. Carolyn R. Bertozzi实验室从事博士后研究工作。其相关研究工作分别以第一作者身份发表在 PNAS, JACS, Angew 等期刊，共发表共同作者文章及专利20多篇。2017年，Xiao教授加盟全美顶尖私立大学莱斯大学 (Rice University)。课题组研究方向包括：生物正交化学反应，蛋白质化学修饰，蛋白进化,  抗体偶联，化学生物学以及相关交叉学科。欢迎具有相关背景的人士联系加盟。

Han Xiao

https://www.x-mol.com/university/faculty/49804

实验室主页

http://xiao.rice.edu

Yuda Chen本科毕业于南京大学生物系，硕士毕业于密歇根大学药理系，现为莱斯大学化学系四年级博士生。