基于非正则辅因子的醛类化合物合成

手性化合物是许多药物、农药和精细化学品合成过程中重要且有价值的中间体。对于手性药物分子来说，不同的对映异构体在生物体内可能发挥不同的治疗作用。因此，高光学纯度的对映异构体化合物合成技术在不同领域中越来越受到关注。手性分子可通过有机合成或生物转化的方法获得。与化学催化法相比，利用酶或生物有机体的不对称还原反应具有更多优势，如安全、环保的反应条件，高反应产率，广泛的底物范围和较少的副反应等。尽管相关酶在不对称合成手性化合物领域已取得了令人满意的成果，但在大规模工业化应用方面仍面临一个不可避免的挑战，即各级中间产物易被宿主菌中充斥的NAD(P)-依赖型醇醛脱氢酶催化而流向副产物合成途径。如何有效诱导反应系统中的碳源流向，是研究者们亟待解决的问题。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) 和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADP) 是生命过程中通用的氧化还原辅酶和重要的代谢物。NAD/NADP与各类醛脱氢酶相互作用存在着比较保守的分子识别模式，无论全细胞生物合成或利用细胞粗提液，异源合成途径生成的醛均有可能被宿主菌中的脱氢酶还原为醇，这使得发酵产物组分复杂，且分离有难度，故宿主菌原有的代谢途径和碳源流向需要重新规划。

相对于传统的调节胞内辅因子水平、改造酶的辅因子偏好性及敲除竞争代谢等方法，近年来，加州大学尔湾分校的李晗团队通过一系列工作构建了一种基于非正则辅因子 (Non-canonical redox cofactor)——烟酰胺单核苷酸 (NMN) 的氧化还原催化体系，并筛选出了NMN-依赖型葡萄糖脱氢酶突变体GDH Ortho (Black et.al., 2019)，它们的活性与天然系统正交，通过酶偶联反应可实现NMN的循环再生。在胞内建立途径专一的氧化还原驱动力，可以使目标产物香茅醛 (citronellal) 的合成途径从大肠杆菌氧化还原系统中隔离 (如图1)。经过多轮针对反应物制备过程及反应条件的优化，研究人员使香茅醛在细胞粗提液和全细胞合成中的转化率分别达到了97-100% 和 83%。

图1. (A) 香茅醛在粗提液及全细胞合成中的系统设计和反应方案。(B) 使用天然辅酶NAD(P)作为反应辅酶时, 宿主菌内醇脱氢酶(ADH)将中间代谢产物还原为对应醇，副产物增加。(C) 香茅醛合成途径使用NMN作为唯一辅酶时，宿主菌内醇脱氢酶无法使用该途径中间产物，目的产物转化率显著提高。

重组大肠杆菌利用假单胞菌XenA (Xenobiotic reductase) 达到两种在大肠杆菌中极易被还原的醛之间的转化，由反应结果来看，不同辅因子存在时XenA均可催化柠檬醛 (Citral) 发生加氢反应。当使用宿主菌内源辅酶在细胞粗提液中进行合成时，由于反应物和产物均被还原成醇类，目的反应无法发生。而引入非正则辅酶NMN循环系统后，因胞内累积的还原型辅酶NMNH无法被其他醇醛脱氢酶消耗，该浓度梯度促进了XenA参与的合成反应，并阻断了底物向其他代谢途径的流通，使目的产物转化率升到60%。在进一步应用于全细胞生物合成的过程中，实验组仅对参与NMN循环的代谢途径进行优化，使醇副产物的转化率从60%降至接近0。这主要得益于利用NMN的外源代谢途径与宿主菌内源代谢途径相互独立，使设计和构建高效、受控的物质转化途径成为可能，且对于在难以预测或复杂生物系统中构建人工代谢途径具有重要意义。

相关论文近期发表于ACS Catalysis。

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Aldehyde Production in Crude Lysate- and Whole Cell-Based Biotransformation Using a Noncanonical Redox Cofactor System

Kelly N. Richardson, William B. Black, Han Li*

ACS Catal., 2020, 10, 8898–8903, DOI: 10.1021/acscatal.0c03070