实时三维单分子示踪显微镜

新冠疫情期间，一些科技公司开发出了新冠患者追踪App，可以用来追踪确诊患者行踪路线，从而达到有效预防的目的。追踪患者可以通过手机定位来实现，而如果追踪目标是一个小于1纳米的分子，要得到它们的运动轨迹就不是那么容易了。

图1. 确诊患者行踪路线 图片来源：http://www.ihuawen.com/  

近日，杜克大学的研究人员开发出一种实时三维单分子示踪显微镜，可以连续的获取单个分子在溶液里的运动轨迹。单个分子的示踪时长可以长达几分钟，是之前报道的三维单分子示踪方法的100倍。目前的单分子荧光研究主要是使用全内反射显微镜（total internal reflection fluorescent microscope, TIRFM）。然而全内反射显微镜只有大约100-200 nm的成像深度，而且时间分辨率受限于每帧曝光时间。为了进行单分子观测，目标分子固需要被定在玻片上。这些就限制了其单分子动态研究的能力。为了解决这个问题，杜克大学的Kevin Welsher实验室开发出了一种三维单分子主动示踪显微成像技术（3D single molecule active real-time tracking method, 3D-SMART），可以长时间、高时空分辨的获取单个分子的运动轨迹。相关研究成果近日发表于Nature Communications。

3D-SMART使用一个可调声梯度透镜（Tunable acoustic gradient lens）和一对电光偏转器（Electro-Optic Deflector）来实现激光焦点在物镜后的三维扫描 (见图2)。当检测器APD收到荧光信号之后， FPGA通过定位算法根据荧光光子的到达时间信息计算出荧光分子在三维激光扫描区域中的位置信息。得到荧光分子后，移动纳米平移台通过主动反馈将荧光分子重置在激光扫描区域的中心。在这种情况下纳米平移台始终追随着荧光分子运动，通过记录纳米平移台的三维 运动轨迹即可得到荧光分子的运动轨迹。

图2. 3D-SMART示意图

研究人员将3D-SMART用来示踪90%甘油溶液中的Atto 647N荧光分子，最长可以示踪160 s（图3）。而通过对均方位移（MSD）的拟合可以得到分子的水合直径是1纳米左右。通过比较打开和关闭主动反馈，发现主动反馈可以将示踪时长和示踪总光子数提升两个数量级。

图3. 使用3D-SMART示踪单个荧光分子

接下来研究人员将3D-SMART 应用于示踪生物分子（图4）。研究人员示踪了73%甘油溶液中的单个荧光分子标记的BSA蛋白。当BSA上标记了两个荧光分子时，可以观测到荧光闪烁现象。接着作者在不同浓度的甘油溶液中示踪了不同长度的DNA分子。当使用1385 bps的DNA分子时，研究人员成功的实现了在0% 甘油浓度下的单个荧光分子标记的DNA示踪。此外，3D-SMART还被用于提取液相中的单分子分布。在此，研究人员对溶液中的单条mRNA进行示踪，并通过荧光信号强度对结合上mRNA的荧光小分子进行定量。定量结果表明单分子示踪相比于平均测量方法可以得到更准确的单分子分布信息。

图4. 3D-SMART用于示踪生物分子

最后，研究人员使用双检测通道3D-SMART实时观测了DNA转录mRNA的过程（图5）。在这里研究人员使用fastFISH的方法来标记mRNA。一个可以自发淬灭的与mRNA序列互补的单链DNA被用作mRNA探针。此单链DNA的两端分别标记了一个绿色荧光分子和一个荧光淬灭基团。当此它没有结合到mRNA上的时候，绿色荧光分子距离淬灭基团较近，处于暗态。当它结合到mRNA上之后，单链DNA被拉直，绿色荧光染料分子处于亮态，可以发射荧光。相比于传统的单分子成像方法，3D-SMART不仅免除了将样品固定在玻片上所带来的影响，还增加了一个分析维度（扩散系数）。通过比较mRNA信号通道的荧光和双链DNA扩散系数发现当mRNA信号通道的荧光增强时伴随着双链DNA扩散系数的下降，表明了RNA聚合酶与双链DNA的结合。

图5. 使用3D-SMART观测DNA转录过程

总结，3D-SMART 将单分子成像研究从受限的小区域观测中解放了出来，提供了一个实时、三维、高时空分辨的单分子动态观测方法，极大的拓展了单分子成像的范围，以后可广泛应用于生物以及化学单分子动态研究中。

文章的第一作者为杜克大学化学系博士后侯尚国，通讯作者为杜克大学助理教授Kevin Welsher。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Real-time 3D single molecule tracking

Shangguo Hou, Jack Exell, Kevin Welsher

Nat. Commun., 2020, 11, 3607, DOI: 10.1038/s41467-020-17444-6

研究团队简介

侯尚国博士和Kevin Welsher教授于2015年加入杜克大学化学系并建立实验室。实验室致力于开发新型显微成像方法以研究生物系统中的动态过程。此前，侯尚国博士与Kevin Welsher教授研制出了多种实时三维单颗粒示踪成像方法，包括3D-DyPLoT和3D-PART，并将其用来研究病毒侵染细胞的初期过程，相关研究结果发表于Optics Letters、Small等期刊上。侯尚国博士曾获杜克大学FIP光子研究所杰出博后讲座奖（2020）和杜克大学杰出博后提名奖（2019）。

实验室主页

https://www.welsherlab.org